酿酒酵母中前导链与后随链端粒末端结构不对称性揭示末端复制问题的本质

《Cell Reports》：Asymmetrical end structures of leading and lagging telomeres in Saccharomyces cerevisiae dictate the nature of the end replication problem

本研究针对端粒末端复制问题的分子机制这一长期悬而未决的难题，通过构建酿酒酵母合成新生端粒系统，首次揭示了前导链和后随链端粒在复制后具有截然不同的末端结构：前者为Yku保护的平末端，后者则带有约10 nt的3'突出端。研究进一步鉴定RNase H2是负责移除后随链端粒末端RNA引物的关键核酸酶，其缺失导致RNA引物滞留，从而减缓端粒酶缺失细胞的端粒缩短和衰老进程。这些发现挑战了广为接受的“填充”模型，为理解端粒复制/维持机制提供了新框架。

　　

生命的时钟——端粒，如同鞋带两端的塑料套，保护着染色体末端免于磨损和融合。然而，每次细胞分裂时，染色体末端的DNA复制都会面临一个棘手的“末端复制问题”，导致端粒逐渐缩短。当端粒缩短到临界长度，细胞便会走向衰老或死亡。为了对抗这种损耗，大多数真核生物演化出了端粒酶来延长端粒。长期以来，科学界普遍接受“填充”模型，认为无论是前导链还是后随链复制产生的端粒，最终都会经过加工形成相同的3'单链突出端，因此两端都会缩短。但实际观测到的酵母端粒缩短速率（每代2-3 bp）远低于该模型的预测（每代约5 bp），这一矛盾成为了领域内一个长期未解之谜。此外，位于染色体最末端的那个RNA引物是如何被移除的，其机制也一直不清楚。发表在《Cell Reports》上的这项研究，正是为了深入揭示端粒末端复制的真实过程，挑战旧有模型，解答这些根本性问题。

研究人员综合运用了合成生物学、细胞生物学和基因组学等多种技术手段。核心是利用CRISPR-Cas9系统在酿酒酵母中诱导产生长度均一的新生端粒，这一模型系统便于高精度追踪单个端粒的末端加工事件。他们通过细胞周期同步化技术控制DNA复制进程，并结合核酸酶（如Exo I、RNase H）体外消化、高分辨率的天然及变性Southern blotting，精确分析端粒末端的结构。此外，还采用了改良的基因组末端测序技术（native END-seq）无偏性地检测天然端粒的平末端，并通过端粒PCR扩增子测序分析端粒长度动态和同源重组事件。研究涉及的样本包括多种基因敲除酵母株（如yku70Δ、exo1Δ、rnh201Δ、tlc1Δ等），以探究不同蛋白在端粒保护和处理中的作用。

新生端粒具有长的端粒序列且不易被末端加工

为了精确解析端粒末端的加工事件，研究团队利用了一个已知具有敏感读数的诱导型新生长端粒系统。该工程化染色体臂包含一段250 bp的TG_1-3/C_1-3A端粒序列。通过半乳糖诱导的gRNA表达，组成型表达的Cas9在靶位点产生双链断裂，形成一个平末端的新生端粒。研究发现，在G2/M期诱导的新生端粒非常稳定，其末端限制性片段（E-TRF）的信号随着诱导时间增加而增强，且对Exo I消化不敏感，表明其保持平末端结构。即使在G1期形成的端粒也表现出相同的特性。

Yku保护新生端粒免受Exo1介导的切除

端粒通常被Rap1、Rif1、Rif2和Yku等蛋白结合和保护。为了探究新生端粒末端的稳定维持是否需要Yku或Rif2，研究人员检测了yku70Δ和rif2Δ突变体中新生端粒的末端结构。发现在yku70Δ细胞中，部分新生端粒末端发生了5'切除，产生了约24 nt的3'突出端，并且这一过程依赖于Exo1。而在exo1Δ或yku70Δ exo1Δ双突变体中，新生端粒则保持平末端结构。这表明在野生型细胞中，Yku保护新生端粒末端，防止Exo1介导的切除。

复制后前导链端粒保持稳定的平末端

为了监测新生端粒经过一轮复制后子代端粒（推测类似于天然端粒）的末端加工，研究人员在诱导新生端粒后，将细胞阻滞在S期早期，然后释放进入细胞周期。复制前，端粒末端是平的。复制后，E-TRF的迁移速率稍慢，经Exo I消化后，观察到107 bp和97 bp两条带，分别对应平末端和带有突出端的端粒，其比例相近。变性Southern blotting进一步显示了每条链的精确长度。这些结果表明，两个子代端粒具有不同的结构：一个是平末端，另一个带有约10 nt的3'突出端。这一发现与“填充”模型相悖，而支持了一个子代端粒为平末端，另一个带有约10 nt 3'突出端的模型。通过在其他突变体（如mre11Δ、sae2Δ、sgs1Δ）中的验证，排除了前导链端粒因切除而产生突出端的可能性，从而支持前导链端粒在复制后保持平末端的结论。

平末端在天然端粒上普遍存在

由于新生端粒系统的结果表明前导链端粒是平末端，这与之前报道的天然端粒具有3'突出端的结果相矛盾。为了确认平末端是否也是天然端粒的普遍结构，研究人员使用了末端测序技术（END-seq），并进行了改良（称为native END-seq），使其能够特异性捕获天然的平末端。结果显示，在G2/M期细胞中，端粒区域信号高度富集，这些测序读长与注释的端粒对齐。通过点杂交实验定量分析，发现约46.3%的天然端粒具有平末端，这与新生端粒的结果一致。

平末端的前导链端粒受到Yku的保护

由于Yku70/80异源二聚体在G2/M期保护新生端粒免受Exo1核酸酶切割，且前导链端粒在结构上类似于G2/M期诱导的新生端粒，研究人员推测Yku也保护前导链端粒。在yku70Δ细胞中分析端粒末端结构发现，复制前部分端粒就被切除。复制完成后，亲本端粒的107 bp条带逐渐减少，而代表去保护的子代端粒（包括前导链1、后随链1和后随链2）的信号变得显著，它们含有>20 nt的3'突出端，对Exo I敏感。一小部分子代端粒（对应于子代前导链2）显示出83 bp的E-TRF，对Exo I不敏感，表明其具有平末端，可能受到Rap1的保护。在exo1Δ和yku70Δ exo1Δ细胞中，端粒的长度和结构与野生型细胞相似，且未观察到83 bp条带，说明CA链的切除是由Exo1介导的。这些结果支持Yku保护平末端的前导链端粒和带有3'突出端的后随链端粒，防止Exo1介导的CA链切除。

后随链端粒上的RNA引物在复制后被移除

对于后随链端粒，RNA引物需要被移除以暴露3'突出端供Cdc13结合和保护。为了确认RNA引物是否已从后随链端粒上移除，研究人员结合RNase H（用于消化DNA-RNA杂交体）处理来检查端粒末端结构。验证实验表明，带有DNA-RNA杂交末端的寡核苷酸对Exo I消化不敏感，但经RNase H预处理后，RNA部分被移除，留下10 nt的3'突出端，可被Exo I修剪。在野生型细胞中，复制后无论是否经RNase H处理，端粒结构相似，表明后随链端粒末端的RNA引物（约10 nt长）在复制过程中或之后已被移除。

RNase H2主要负责移除后随链端粒的RNA引物

为了确定哪种核酸酶负责移除末端RNA引物，研究人员构建了RNase H编码基因（RNH201和RNH1，分别编码RNase H2和H1的催化亚基）的单突变体和双突变体。在rnh201Δ突变体中，前导链端粒对Exo I不敏感，而后随链端粒（在野生型中对Exo I敏感）变得对Exo I不敏感，表明其缺乏3'突出端。重要的是，体外RNase H处理使得约一半的107 bp E-TRF变得对Exo I敏感，产生97 bp长的条带。这表明在缺乏RNase H2时，RNA引物滞留在后随链端粒上。在rnh1Δ细胞中，后随链端粒能被Exo I有效修剪，表明其含有约10 nt的突出端，RNA引物几乎完全被移除。在rnh201Δ rnh1Δ双突变体中，rnh201Δ中观察到的微弱97 bp条带完全消失，表明Rnh1在RNA引物移除中起冗余但次要的作用。因此，RNase H2是主要负责移除后随链端粒末端RNA引物的酶。通过插入转录终止子阻断端粒重复序列RNA（TERRA）的表达，排除了TERRA形成的DNA-RNA杂交体对端粒结构分析的干扰，证实是DNA-RNA引物杂交体导致后随链对Exo I消化产生抗性。

后随链RNA引物的移除是末端复制问题的主要原因

为了排除末端非TG序列对子代端粒处理的影响，研究人员在端粒酶缺失细胞中连续传代观察新生端粒的长度变化。如果前导链通常保持平末端，端粒将以每代2.5 bp（RNA引物长度的四分之一）的速率缩短；如果前导链也经历末端加工（填充模型），则缩短速率为每代5 bp（RNA引物长度的一半）。实验结果显示，端粒缩短模式与不对称末端模型吻合良好，平均缩短速率约为每代2.5 bp，而与填充模型的预测相差甚远。这表明平末端的前导链端粒对末端复制问题的贡献很小。由于末端复制问题主要由RNA引物移除引起，研究人员推测RNA引物滞留可能阻止端粒在连续细胞分裂中缩短。实验发现，与tlc1Δ细胞相比，rnh201Δ tlc1Δ和rnh1Δ rnh201Δ tlc1Δ细胞中的端粒缩短更慢，信号更集中。而在rnh1Δ tlc1Δ细胞中，端粒缩短速率与tlc1Δ细胞相当。这证实了RNase H2（而非RNase H1）是端粒酶缺失细胞中移除最后一个RNA引物的主要责任者，RNA引物滞留能够抵消端粒侵蚀。通过消除TERRA表达，发现其并不改变端粒在tlc1Δ和tlc1Δ rnh201Δ细胞中的缩短速率，表明RNase H2失活减缓端粒缩短是独立于TERRA R环的。此外，端粒PCR扩增子测序分析表明，同源重组并非rnh201Δ细胞中端粒缩短减慢的原因。在tlc1Δ rnh201Δ exo1Δ三突变体中观察到最慢的端粒缩短，提示DNA-RNA引物杂交体通过阻止Exo1切除来减缓端粒缩短。这些结果支持了后随链端粒RNA引物的移除是末端复制问题的主要原因，但Exo1等核酸酶对DNA的进一步修剪也贡献于端粒缩短。

端粒处RNA引物滞留延缓细胞衰老

基于以上观察，研究人员得出结论：酵母端粒存在两种末端类型，一种是平末端，另一种是3'突出端，分别是前导链和后随链复制的产物。在端粒复制过程中，如果亲本端粒是平末端（如前导链复制的产物），则经过一轮复制后，前导链端粒被完全复制，形成Yku保护的平末端；后随链端粒的RNA引物被RNase H2移除，导致CA链缩短10 nt，产生一个由Cdc13以及Yku在单双链连接处保护的3'突出端。如果亲本端粒含有10 nt突出端（如后随链复制的产物），则后随链端粒以较长的TG链为模板，经RNase H2介导的RNA引物移除后，产生一个10 nt的3'突出端，与亲本端粒相同；然而，前导链端粒以缩短了10 nt的CA链为模板，其完全复制产生一个比亲本端粒短10 bp的平末端产物。这种不对称末端模型强调，后随链复制中RNA引物的移除是端粒缩短的主要原因，其后果在后续的前导链端粒复制周期中变得愈发严重。在端粒酶缺失的情况下，端粒逐渐缩短，当端粒缩短到临界长度时，细胞发生衰老。由于RNA引物滞留能减缓端粒缩短，研究人员进一步检验了其是否也能延缓端粒酶缺失细胞的衰老。在固体平板或液体培养基中传代培养发现，rnh201Δ tlc1Δ细胞的衰老时间晚于tlc1Δ和rnh1Δ tlc1Δ细胞，延缓了约20-50代。在消除TERRA干扰的单染色体TERRA-free酵母菌株中，也观察到RNase H2的缺失显著延缓了由端粒缩短触发的衰老进程。端粒长度分析进一步证实，Rnh201的失活能减缓端粒缩短，从而延迟细胞衰老，且该过程不依赖于TERRA DNA-RNA杂交体。

本研究发现了复制后前导链端粒具有平末端，并且平末端在天然端粒上普遍存在，这挑战了认为酵母端粒末端均为保护性3'突出端的传统观点。该研究鉴定出Rnh201介导的末端RNA引物移除，与之前发现Rnh201降解端粒上DNA-RNA杂交体中的RNA以及参与DNA复制中冈崎片段成熟的结论一致。在端粒酶正常的细胞中，删除RNH201或RNH1或两者并不改变端粒长度，说明RNA引物滞留对端粒酶活性影响很小。在缺乏RNase H2的情况下，细胞衰老的延迟被归因于端粒处DNA-RNA引物杂交体的积累，这种杂交体能够抵抗倾向于降解带有短3'突出端的双链DNA的Exo1的核酸外切酶活性，从而发挥保护作用，减缓端粒缩短。总之，该研究结果表明，完全复制的前导链端粒以Yku保护的稳定平末端终结，而后随链端粒则包含一个3'突出端，这完美地再现了最初的提议，即后随链端粒由于RNA引物的固有移除而成为末端复制问题的主要根源，而完全复制的前导链端粒对末端复制问题的贡献很小。这种不对称末端模型解决了一个关键悖论：观察到的端粒每代2-3 bp的缩短速率与每两次细胞分裂丢失一个RNA引物（约10 nt）的情况相符。

该研究也存在一定的局限性。尽管提出了酿酒酵母端粒复制的不对称末端模型，但酵母与人类细胞的端粒长度、结合蛋白和末端加工存在显著差异。人类细胞中是否存在平末端的前导链端粒仍有待确定。此外，哺乳动物的3'突出端比酵母长得多，最后一个RNA引物的移除机制在哺乳动物中是否与酵母相同尚不清楚。而且，酵母中的端粒酶可以作用于端粒以延长G链，随后由Polα-引物酶和Polδ进行C链合成。端粒酶延伸的端粒上的RNA引物是否也由RNase H2移除，也有待阐明。