ATXN2L通过液液相分离增强mRNA翻译促进肝细胞癌进展的机制研究

《Cell Reports》：Liquid-liquid phase separation of ATXN2L enhances mRNA translation in hepatocellular carcinoma

本刊推荐：为解决肝细胞癌(HCC)中RNA结合蛋白(RBP)调控mRNA翻译的机制不明问题，Wang等开展了ATXN2L(ataxin 2-like)通过液液相分离(LLPS)调控翻译起始的研究。发现ATXN2L通过LLPS形成凝聚体招募eIFs(如EIF4A1)和靶mRNA(如ADAM9)，并与应激颗粒(SGs)共定位增强致癌蛋白翻译，揭示其可作为HCC治疗新靶点。

　　

肝细胞癌(HCC)是全球范围内发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤，其五年生存率不足50%，主要归因于肿瘤的高转移性和复发率。尽管近年来手术、放疗、化疗及靶向治疗等多种手段不断发展，但疗效仍十分有限。因此，深入探索HCC发生发展的新分子机制，对于寻找新的治疗靶点、改善患者预后至关重要。

在分子层面，基因表达的精细调控对肿瘤的发生至关重要。这不仅包括基因的转录水平，更涉及转录后调控。RNA结合蛋白(RBPs)作为转录后调控的核心执行者，能够通过调控RNA的剪接、稳定性、定位、翻译和降解等过程，帮助癌细胞动态重编程其蛋白质组，从而影响癌基因和抑癌基因的表达。许多RBPs在HCC中存在异常表达，并通过独特的机制驱动肿瘤进展。然而，仍有许多HCC相关的RBPs及其具体作用机制尚待揭示。

近年来，液液相分离(LLPS)作为一种新的生物大分子组织方式受到广泛关注。LLPS驱动生物大分子在细胞内形成无膜包裹的凝聚体，这些凝聚体如同微小的反应器，可以富集特定分子，从而高效调控包括基因转录、信号转导在内的多种生物学过程。值得注意的是，许多RBPs含有固有的无序区域(IDRs)或低复杂度结构域(LCDs)，这些结构域使其易于发生LLPS，进而组装成核糖核蛋白(RNP)颗粒，精细调控癌蛋白的表达。那么，在HCC中，是否存在关键的RBP通过LLPS机制发挥功能？这成为了一个亟待解答的科学问题。

为了解决这一问题，发表在《Cell Reports》上的这项研究进行了一项系统的筛选。研究人员通过分析Huh7细胞系和HCC患者的多个数据集，初步筛选出44个差异表达的RBPs。随后，结合生存分析等严格标准，他们将目光锁定在ATXN2L(ataxin 2-like)上。临床样本分析证实，ATXN2L在HCC组织中显著高表达，且其高表达与患者的不良预后密切相关。这提示ATXN2L可能在HCC进展中扮演着重要角色。

为了验证这一假设，研究人员运用了多种关键技术方法。他们构建了稳定敲低ATXN2L的HCC细胞系，并在小鼠模型中实现了肝细胞特异性敲除Atxn2l，结合piggyBac转座子系统诱导HCC，进行体内外功能验证。通过免疫共沉淀(Co-IP)、RNA免疫共沉淀(RIP)、RNA pull-down、体外结合实验、体外翻译系统、免疫荧光(IF)共定位、荧光漂白恢复(FRAP)等多种分子和细胞生物学技术，深入探究了ATXN2L的LLPS特性、其与翻译起始因子(eIFs)和靶mRNA的相互作用，以及其功能如何受应激颗粒(SGs)调控。

ATXN2L促进HCC的进展和转移

研究结果显示，在细胞水平上，敲低ATXN2L能够显著抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在动物实验中，无论是皮下移植瘤模型还是基因工程小鼠模型(PB-Atxn2l-CKO)，均证实敲除ATXN2L可以显著抑制肿瘤的生长和肺转移，并延长小鼠的生存期。有趣的是，尽管ATXN2L与ATXN2(ataxin 2)在神经系统中有功能重叠，但本研究发现在HCC中，ATXN2并不具备类似ATXN2L的促癌功能，凸显了ATXN2L在HCC中的独特作用。

ATXN2L颗粒在HCC发展过程中与应激颗粒(SGs)共定位

通过免疫荧光观察，研究人员发现，在HCC发生早期，ATXN2L即可形成颗粒状结构，且随着肿瘤进展，这些颗粒变得更大、更明显。更重要的是，在晚期HCC中，这些大的ATXN2L颗粒与经典的SG标记物G3BP1发生了广泛的共定位。这种共定位现象在HCC患者样本中也得到了证实，并且呈现出颗粒大小依赖性，即只有较大的ATXN2L颗粒才与SGs共定位。这暗示ATXN2L颗粒的成分和功能可能随着HCC的进展而演变，并与SGs建立了密切联系。

ATXN2L加速ADAM9的翻译

机制探索方面，表面传感翻译(SUnSET)实验表明ATXN2L主要影响翻译起始过程。利用AlphaFold 3预测并结合实验验证，发现ATXN2L可以直接结合翻译起始因子EIF4A1，并可能与其他eIFs(如EIF1, EIF3M)共同参与48S起始复合物的组装。通过整合RNA测序(RNA-seq)、核糖体图谱(Ribo-seq)和差异表达基因数据，并结合RIP实验，研究人员将ADAM9(ADAM metallopeptidase domain 9)鉴定为ATXN2L的关键靶mRNA。体外实验证实ATXN2L可直接结合ADAM9 mRNA并增强其翻译效率，而不影响其mRNA水平或蛋白稳定性。

ATXN2L通过ADAM9抑制KRAS的泛素化降解

进一步研究发现，ATXN2L可以通过促进ADAM9的翻译，进而抑制KRAS蛋白的泛素化降解，从而稳定KRAS蛋白水平。这种调控具有特异性，因为另一个重要的HCC相关蛋白β-连环蛋白(β-catenin)的泛素化不受ATXN2L影响。在ATXN2L敲低细胞中过表达ADAM9，可以回救KRAS的蛋白水平和稳定性，证实了ATXN2L-ADAM9-KRAS轴的存在。

应激颗粒(SGs)增强ATXN2L的功能

研究还探讨了SGs的作用。发现eIFs和ADAM9 mRNA均能与SG成分G3BP1相互作用，并且在SG诱导条件下(如砷酸钠SA处理)，ATXN2L与ADAM9 mRNA的结合及其介导的ADAM9蛋白表达均增强。相反，敲低G3BP1抑制SG形成则会削弱ATXN2L的功能。这表明SGs为ATXN2L调控特定mRNA翻译提供了一个功能平台，增强了其促癌效应。

ATXN2L的LLPS对其翻译功能至关重要

最后，研究深入解析了ATXN2L发挥功能的物理化学基础——LLPS。通过构建一系列截短体，发现其第三个低复杂度结构域(LCD3)是驱动LLPS的关键区域。缺失LCD3(ΔLCD3)的ATXN2L无法形成动态的凝聚体，也失去了与eIFs共定位、结合ADAM9 mRNA以及促进其翻译的能力。然而，当将ΔLCD3与另一个强LLPS驱动域(如FUS蛋白的IDR域)融合后(ΔLCD3-IDR^FUS)，这些功能均得以恢复。体内外实验均证实，ΔLCD3无法回救ATXN2L敲低或敲除导致的表型缺陷，而ΔLCD3-IDR^FUS则能有效回救肿瘤生长和转移。这强有力地证明了ATXN2L的LLPS活性是其发挥促癌功能的核心机制。同时，研究也指出ATXN2L的其他结构域(如RNA结合域和PAM2域)也参与调控其功能，与LCD3协同作用。

总结与展望

综上所述，本研究系统性地揭示了一条此前未知的HCC进展调控通路：高表达的RBP ATXN2L通过其LCD3结构域发生LLPS，形成生物分子凝聚体。这些凝聚体招募翻译起始因子和特定的靶mRNA(如ADAM9)，形成一个高效的翻译机器，促进致癌蛋白的合成。随着HCC进展，这些ATXN2L凝聚体进一步与应激颗粒(SGs)共定位，可能获得更强大的翻译激活能力，从而更有效地驱动肿瘤恶性进展。

这项研究的意义在于：首先，它首次揭示了ATXN2L作为一个重要的致癌RBP在HCC中的关键作用，并阐明了其不同于同源蛋白ATXN2的独特功能。其次，它创新性地将LLPS机制与mRNA翻译调控联系起来，为理解HCC的分子 pathogenesis提供了新视角。第三，研究揭示了SGs在晚期HCC中可能扮演的促癌角色，挑战了其传统上被认为主要抑制翻译的观点，为SG生物学研究提供了新的思路。最后，ATXN2L及其LLPS过程被鉴定为潜在的HCC治疗新靶点，为未来开发靶向相分离的抗癌策略奠定了理论基础。

当然，本研究也存在一些局限性，例如临床样本量有待扩大，小鼠模型未能完全模拟所有类型的HCC发生背景(如脂肪性肝炎相关HCC)，以及ATXN2L在HCC起始阶段的具体作用等，这些都有待未来更深入的研究。总之，这项发表于《Cell Reports》的工作深化了我们对HCC中转录后调控机制的认识，为开发新的治疗策略带来了希望。