CARD11调控p100加工增强非经典NF-κB信号通路并促进边缘区B细胞扩增

《Cell Reports》：Potentiation of noncanonical NF-κB signaling and marginal zone B cell expansion by CARD11-mediated regulation of p100 processing

本研究报道了淋巴瘤相关CARD11 C49Y功能获得性突变通过上调p100蛋白水平，抑制其基础加工过程，从而增强非经典NF-κB信号通路，导致边缘区B细胞特异性扩增。该研究揭示了CARD11在B细胞稳态调控中的新功能，为理解相关淋巴瘤发病机制提供了新视角。

　　

在适应性免疫系统中，B细胞和T细胞的正常功能依赖于精确的信号转导网络，其中CARD11信号支架蛋白扮演着关键角色。当B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）与抗原结合后，CARD11被激活并介导下游多条信号通路的活化，包括经典核因子κB（NF-κB）、mTOR、JNK和AKT通路。然而，CARD11的功能获得性（GoF）突变与多种淋巴瘤的发生密切相关，这些突变使CARD11能够绕过正常的自抑制机制，导致信号分子持续异常活化。

尽管以往研究主要集中在CARD11 GoF突变对经典NF-κB通路的激活作用，但其对B细胞生物学特性的具体影响机制尚未完全阐明。特别是，CARD11 GoF突变如何影响非经典NF-κB信号通路——这一在B细胞稳态和存活中至关重要的通路——仍是一个待解之谜。非经典NF-κB通路主要受BAFF等配体激活，通过NF-κB诱导激酶（NIK）和IKKα激酶调控p100蛋白加工生成p52，后者与RelB形成异源二聚体转入核内调节靶基因表达。

为了深入探究CARD11 GoF突变对B细胞的影响，研究人员构建了携带淋巴瘤相关CARD11 C49Y点突变的基因敲入小鼠模型。令人惊讶的是，表达CARD11 C49Y突变的小鼠表现出明显的脾肿大和B细胞扩增，其中边缘区（MZ）B细胞的扩增尤为显著。深入机制研究发现，CARD11 C49Y并不像预期那样持续激活经典NF-κB通路，而是通过一种前所未有的机制——抑制p100的基础加工过程，导致p100蛋白水平积累，从而增强非经典NF-κB信号通路。

具体而言，CARD11 C49Y通过抑制NIK诱导的p100基础磷酸化和加工，使得p100在细胞质中大量积累。当BAFF等配体激活非经典NF-κB通路时，积累的p100被高效加工为p52，导致p52:RelB异源二聚体大量核转位，进而增强下游基因的转录激活。这种调控机制在MZ B细胞中尤为明显，解释了为什么CARD11 C49Y纯合小鼠的MZ B细胞数量增加了14.1倍。

本研究发表在《细胞报告》（Cell Reports）杂志上，研究人员运用了多种关键技术方法，包括：基因敲入小鼠模型的构建与分析、流式细胞术进行免疫细胞分型和功能分析、蛋白质免疫印迹检测信号通路活性、细胞培养与体外功能实验（增殖、凋亡、信号通路抑制实验）、RNA测序与生物信息学分析、免疫共沉淀与报告基因检测等。小鼠样本均为研究团队通过基因工程技术获得并培育。

Splenomegaly and expansion of follicular and MZ B cells in CARD11 C49Y mice

研究发现CARD11^C49Y/C49Y小鼠脾脏明显肿大，脾细胞总数增加3.0倍，而CARD11^+/C49Y杂合小鼠脾细胞增加1.9倍。B细胞数量在杂合和纯合突变小鼠中分别增加1.9倍和3.5倍，其中MZ B细胞的扩增最为显著——纯合突变小鼠MZ B细胞数量增加14.1倍。这表明CARD11 C49Y表达足以驱动B细胞扩增，且对MZ B细胞的影响最为显著。

Robust antibody responses following immunization of CARD11 C49Y mice

尽管CARD11^C49Y/C49Y小鼠在免疫后生发中心B细胞和浆细胞分化存在缺陷，但通过B细胞数量的增加补偿了这一缺陷，导致对TD和TI抗原的抗体反应正常或增强。与以往报道的BENTA患者不同，CARD11 C49Y小鼠能够产生有效的免疫应答，血清IgM、IgG1和IgG2a水平基础升高，免疫后抗原特异性抗体产生增强。

CARD11 C49Y enhances B cell proliferation and survival in vitro in a cell-type-, stimulus-, and genotype-specific manner

体外实验显示CARD11 C49Y对B细胞增殖和存活的影响具有细胞类型、刺激信号和基因型特异性。在抗IgM刺激下，CARD11^+/C49Y滤泡（FO）B细胞增殖优势明显；而在LPS刺激下，CARD11^C49Y/C49YFO B细胞增殖更强。对于MZ B细胞，CARD11^C49Y/C49Y基因型在抗IgM或LPS刺激下均显示出最强的增殖优势和抗凋亡能力。

Absence of constitutive signaling to canonical NF-κB, mTOR, JNK, and AKT in CARD11 C49Y-expressing B cells

令人意外的是，在CARD11 C49Y表达的B细胞中未检测到经典NF-κB、mTOR、JNK或AKT-FOXO1通路的组成性激活。尽管CARD11 C49Y能够诱导MALT1蛋白酶活性（表现为HOIL1的切割），但这种增强的蛋白酶活性与NF-κB激活增强无关。这表明CARD11 C49Y的作用机制不同于传统的信号通路持续激活模式。

Gene set enrichment analysis of CARD11 C49Y-expressing B cells identifies correlates of proliferation, survival, and noncanonical NF-κB pathway potentiation

基因集富集分析显示，CARD11^C49Y/C49YMZ B细胞中与非经典NF-κB信号通路相关的基因集显著富集。差异基因表达分析发现大量基因表达改变，但未发现ABC DLBCL特征基因的富集，进一步证实CARD11 C49Y不通过持续激活经典NF-κB通路发挥作用。

Enhanced survival of CARD11C49Y/C49Y MZ B cells in vitro

CARD11^C49Y/C49YMZ B细胞在无刺激条件下表现出显著的生存优势，且这种优势是细胞自主性的，并非通过自分泌因子介导。BAFF处理可进一步增强其存活，且这种增强效应依赖于非经典NF-κB信号通路。

CARD11 C49Y dysregulates the noncanonical NF-κB pathway in MZ B cells in a dose-responsive manner

CARD11 C49Y以基因剂量依赖的方式上调p100蛋白水平，但不影响NF-κB2 mRNA水平。在BAFF刺激下，CARD11^C49Y/C49YMZ B细胞中p52和RelB的核转位显著增强。机制上，CARD11 C49Y抑制p100的基础磷酸化，而不影响NIK或IKKα蛋白水平。

Activated CARD11 inhibits NIK-induced p100 processing by a mechanism independent from canonical NF-κB signaling

在HEK293T细胞异源表达系统中，多种开放构象的CARD11 GoF突变体（C49Y、L251P、G123D等）均能抑制NIK诱导的p100加工，且这种抑制不依赖于IKKγ介导的经典NF-κB信号通路。结构域分析显示，CARD、coiled-coil、L3和SH3结构域是抑制p100加工所必需的，而与经典NF-κB激活所需的L4和GUK结构域不同。

CARD11 is required for normal p100 protein levels in FO and MZ B cells

CARD11^-/-B细胞中p100蛋白水平显著降低，但NF-κB2 mRNA水平不变，p52/p100比值升高，表明CARD11对于维持生理性p100蛋白水平是必需的。野生型CARD11在BCR激活后可能通过类似机制调控p100稳定性。

Gene dose and oligomer composition both contribute to MZ B cell expansion in homozygous CARD11 C49Y mice

CARD11 C49Y的基因剂量（而非寡聚体组成）是决定MZ B细胞扩增表型的关键因素。CARD11^C49Y/C49Y纯合子B细胞中p100蛋白水平最高，与MZ B细胞扩增程度相关。

本研究揭示了CARD11调控非经典NF-κB通路的新机制：通过抑制p100的基础加工促进其积累，从而增强BAFF诱导的信号输出。这种机制在MZ B细胞中尤为显著，解释了CARD11 GoF突变导致MZ B细胞特异性扩增的现象。与以往认识不同，CARD11 C49Y并不持续激活经典NF-κB通路，而是通过调控p100稳定性来增强B细胞存活和扩增。

该研究的创新点在于发现了CARD11在非经典NF-κB通路中的新功能，并揭示了CARD11 GoF突变导致B细胞扩增的特异性机制。这不仅深化了对CARD11信号多样性的理解，也为相关淋巴瘤的治疗提供了新的潜在靶点。特别值得注意的是，这种调控机制具有细胞类型特异性，主要影响MZ B细胞，这可能是由于不同B细胞亚群对非经典NF-κB信号依赖性的差异所致。

研究还发现，CARD11 GoF突变体抑制p100加工的能力与其构象状态相关，多种开放构象的突变体均具有此功能，表明这是激活态CARD11的共性而非C49Y突变特有。这为理解不同CARD11 GoF突变在淋巴瘤中可能产生的共同效应提供了新视角。

总之，这项研究揭示了CARD11在B细胞稳态调控中前所未知的新功能，为理解免疫信号网络的复杂性和开发相关疾病治疗策略提供了重要理论基础。未来研究可进一步探索CARD11如何精确调控p100加工的具体分子机制，以及这种调控在生理和病理条件下的更广泛意义。