结直肠癌中肿大肿瘤引流淋巴结来源的CD8+MT+效应T细胞通过增强抗肿瘤免疫改善预后

《Cell Reports》：CD8+MT+ effector T cells from enlarged tumor-draining lymph nodes enhanced anti-tumor immunity and improved prognosis in colorectal cancer

本研究针对肿瘤引流淋巴结（TDLN）异质性在结直肠癌（CRC）免疫调控中的作用机制不清的问题，通过单细胞和bulk RNA测序技术，系统解析了CRC患者TDLN的免疫景观。研究发现肿大的非转移性TDLN（L-TDLN）富含具有应激适应表型和更强细胞毒性的CD8+MT+效应T细胞（Teff），这些细胞可从L-TDLN迁移至肿瘤部位，其高水平浸润与患者更好的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）显著相关，尤其在接受辅助化疗（AT）的患者中获益更明显。该研究揭示了L-TDLN在塑造有效抗肿瘤免疫中的关键作用，为CRC的预后评估和免疫治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点。

　　

在结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的战场上，免疫系统与肿瘤细胞的博弈决定着患者的命运。肿瘤引流淋巴结（Tumor-Draining Lymph Nodes, TDLNs）作为这场博弈的关键“指挥中心”，负责激活和调度抗肿瘤免疫细胞。然而，并非所有TDLNs都能有效履行职责。临床上观察到，一些TDLNs会显著肿大（L-TDLNs），而另一些则保持较小体积（S-TDLNs）。更令人困惑的是，拥有更多L-TDLNs的CRC患者往往预后更好，但其背后的细胞和分子机制一直是个未解之谜。传统研究常将TDLNs视为均质实体，忽视了其内在异质性可能对免疫应答产生的决定性影响。

为了揭开L-TDLNs增强抗肿瘤免疫的奥秘，由蒋天通飞、管旭等研究人员组成的团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现。他们利用前沿的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，结合大量RNA测序（bulk RNA-seq）、多重免疫荧光（mIF）染色、单细胞T细胞受体测序（scTCR-seq）以及空间转录组学分析，对来自500多名中国CRC患者的多中心队列（包括CAMS-SC、CAMS-1、CAMS-2、SXCH-1、SXCH-2队列）的样本进行了深入剖析，样本类型涵盖CRC肿瘤组织、L-TDLNs、S-TDLNs和转移性TDLNs（M-TDLNs）。研究旨在精确绘制TDLNs的免疫细胞图谱，并鉴定出其中发挥关键作用的特定细胞亚群。

scRNA-seq揭示TDLNs中T细胞的异质性

研究人员首先对13个新鲜CRC样本（包括癌组织、L-TDLNs、S-TDLNs和M-TDLNs）进行了scRNA-seq分析，共获得110,837个细胞的转录组数据。分析结果显示，不同组织的细胞组成存在显著差异。与S-TDLNs和M-TDLNs相比，L-TDLNs中CD8⁺效应T细胞（CD8⁺ Teff）的比例显著升高，提示L-TDLNs可能具有更强的抗肿瘤细胞毒性活性。

L-TDLNs中富集CD8⁺MT⁺ T细胞

对CD8⁺ T细胞进行更精细的分群后，研究团队发现了一个独特的细胞亚群：CD8⁺MT⁺效应T细胞（CD8⁺MT⁺ Teff）。这类细胞高表达金属硫蛋白（Metallothionein, MT）家族基因（如MT1X, MT2A）以及热休克蛋白基因（如HSPA1A, HSPA1B），表现出一种应激适应表型。同时，它们也高表达颗粒酶（GZMA, GZMK）、穿孔素（PRF1）和细胞因子（IFNG）等细胞毒性分子。值得注意的是，CD8⁺MT⁺ Teff细胞及其前体细胞（CD8⁺MT⁺ 初始T细胞）在L-TDLNs中的比例显著高于S-TDLNs，这一发现也通过mIF染色在独立队列中得到了验证。

L-TDLNs中的Teff细胞

通过细胞轨迹推断分析，研究人员描绘了CD8⁺ T细胞在TDLNs中的分化路径：从初始T细胞（CD8⁺CCR7⁺ Tn和CD8⁺MT⁺ Tn）出发，最终分化为效应T细胞（Teff）或耗竭T细胞（Texh）。L-TDLNs来源的细胞主要分布在该轨迹的早中期阶段，而CD8⁺MT⁺ Teff细胞则出现在分化晚期，并伴随着细胞毒性相关基因的上调。与另一群效应细胞（CD8⁺GZMK⁺ Teff）相比，CD8⁺MT⁺ Teff细胞表现出更强的应激相关信号和肿瘤缺氧信号，这可能是其能够适应肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）压力的关键。

L-TDLN特异性的CD8⁺MT⁺ Teff细胞迁移至原发肿瘤组织

一个关键问题是，这些在L-TDLNs中生成的CD8⁺MT⁺ Teff细胞是否会进入肿瘤组织发挥作用？通过对额外患者的配对肿瘤和TDLN样本进行scRNA-seq和scTCR-seq分析，研究人员发现，CD8⁺MT⁺ Teff细胞在L-TDLNs和肿瘤组织中共享大量相同的TCR克隆序列。利用STARTRAC算法计算的迁移指数进一步证实，CD8⁺MT⁺ Teff细胞在L-TDLNs和肿瘤之间存在明显的迁移现象。mIF染色结果也显示，拥有L-TDLNs的患者（L-TDLN组）其肿瘤组织中的CD8⁺MT⁺ Teff细胞数量显著高于仅拥有S-TDLNs的患者（S-TDLN组）。这些证据强有力地支持了CD8⁺MT⁺ Teff细胞从L-TDLNs向肿瘤部位的迁移过程。

CRC肿瘤和TDLNs中CD8⁺MT⁺ Teff细胞的验证

在更大的验证队列（CAMS-1和SXCH-1队列，包含121名I-II期CRC患者）中，bulk RNA-seq分析表明，L-TDLN组的淋巴结和肿瘤组织中，CD8⁺MT⁺ Teff细胞的标志基因（如CD8A, CD8B, MT1X）表达显著上调。功能富集分析显示，L-TDLN组样本的免疫系统激活相关通路（如淋巴细胞活化、T细胞活化正向调节）更为活跃。CD8⁺MT⁺ Teff细胞的富集程度与多种临床病理特征相关，例如在老年患者、女性患者、肿瘤近端淋巴结以及晚期T分期（T3-T4）的样本中更为显著。

CD8⁺MT⁺ Teff细胞在CRC患者中的临床价值

生存分析揭示了CD8⁺MT⁺ Teff细胞重要的预后价值。在CAMS-2队列、SXCH-2队列以及TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中，肿瘤内CD8⁺MT⁺ Teff细胞高水平组的患者，其OS和DFS均显著优于低水平组。多因素Cox分析表明，CD8⁺MT⁺ Teff细胞活性是OS和DFS的独立保护因素。尤为重要的是，辅助化疗（AT）带来的生存获益仅体现在CD8⁺MT⁺ Teff高水平患者中，而在低水平患者中未见明显改善，提示CD8⁺MT⁺ Teff细胞状态可能增强化疗疗效。

结论与讨论

本研究系统性地揭示了CRC中TDLNs的异质性，并鉴定出L-TDLNs中富集的一群关键抗肿瘤免疫细胞——CD8⁺MT⁺ Teff细胞。这群细胞具备强大的细胞毒性和独特的应激适应能力，能够从L-TDLNs迁移至肿瘤部位，直接杀伤肿瘤细胞。其高浸润水平与患者良好的预后密切相关，并可预测辅助化疗的疗效。金属硫蛋白（MT）的表达可能通过维持金属离子稳态、清除活性氧（ROS）和保护细胞免受氧化损伤等机制，赋予CD8⁺ T细胞在恶劣肿瘤微环境中生存和行使功能的能力。此外，研究还发现CD