利用E3连接酶SPOP靶向降解NUP98::KDM5A融合癌蛋白：NUP98重排白血病治疗新策略

《Cell Reports》：Harnessing the E3 ligase SPOP for targeted degradation of the NUP98::KDM5A fusion oncoprotein

本研究针对NUP98重排急性髓系白血病(NUP98-r AML)缺乏直接靶向治疗策略的难题，揭示了E3连接酶SPOP作为新型肿瘤抑制因子调控NUP98融合癌蛋白稳定性的新机制。研究人员开发了基于SPOP的生物PROTAC技术，成功诱导NUP98::KDM5A降解，并在体外和体内实验中证实其可促使白血病细胞分化和凋亡，为NUP98-r白血病治疗提供了创新性靶向蛋白降解策略。

　　

在血液系统恶性肿瘤中，染色体易位导致的融合基因是重要的驱动因素。其中，核孔蛋白98基因(NUP98)与超过30个不同伙伴基因融合形成的NUP98融合癌蛋白，是儿童急性髓系白血病(AML)中与不良预后密切相关的遗传异常。尽管这些融合癌蛋白在白血病发生中起着核心作用，但由于其独特的生物学特性和缺乏直接靶向手段，NUP98重排白血病(NUP98-r AML)至今仍是临床治疗的重大挑战。

NUP98::KDM5A是NUP98最常见的融合形式之一，其阳性患者表现出显著降低的生存率和较高的复发风险。与正常的NUP98蛋白定位于核孔复合体不同，NUP98融合癌蛋白倾向于在细胞核内形成生物分子凝聚体，这些特殊结构通过招募转录共激活因子，驱动致癌基因表达程序。然而，科学家们对这些融合蛋白的稳定性调控机制了解甚少，这严重阻碍了靶向治疗策略的开发。

泛素-蛋白酶体系统(UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径，其失调是癌症的常见特征。本研究团队假设，探索UPS在调控NUP98::KDM5A稳定性中的作用，可能为理解其致癌机制和开发新疗法提供重要线索。

研究人员首先通过分析NUP98融合癌蛋白的相互作用组，发现蛋白质降解相关通路显著富集。他们建立了双荧光报告细胞系，能够精确监测NUP98::KDM5A的蛋白稳定性。基因表达分析显示，NUP98::KDM5A表达会显著上调蛋白酶体相关基因，表明UPS确实参与调控该融合癌蛋白的稳定性。药理实验进一步证实，抑制UPS的不同环节都能提高NUP98::KDM5A的稳定性。

通过CRISPR-Cas9筛选，研究团队鉴定出6个E3连接酶是NUP98::KDM5A稳定性的关键调控因子。其中，SPOP的缺失导致最显著的NUP98::KDM5A积累，并赋予白血病细胞明显的增殖优势。临床数据分析显示，NUP98-r AML患者中SPOP表达显著下调，提示其在NUP98-r白血病中发挥肿瘤抑制功能。

机制研究表明，NUP98蛋白N端的固有无序区域(IDR)包含三个保守的SPOP降解基序。突变这些基序会增强NUP98::KDM5A的稳定性，而SPOP与其结合依赖于功能完整的MATH结构域。重要的是，SPOP对NUP98融合癌蛋白的降解作用具有选择性，对正常NUP98蛋白影响较小，这为靶向治疗提供了潜在的安全窗口。

基于这些发现，研究人员创新性地开发了SPOP-bioPROTAC策略，通过将SPOP与抗GFP纳米抗体融合，诱导SPOP与GFP标记的NUP98::KDM5A近距离接触。令人振奋的是，SPOP-bioPROTAC能在24小时内完全清除NUP98::KDM5A，而基于CRBN和VHL的bioPROTAC仅能实现部分降解。这种降解作用依赖于蛋白酶体活性，并导致NUP98::KDM5A致癌凝聚体的消失。

转录组分析显示，SPOP-bioPROTAC处理的细胞表现出强烈的髓系分化特征，包括HOXA基因簇、CDK6和MEIS1等已知NUP98靶基因的下调，以及髓系分化标志物的上调。功能上，NUP98::KDM5A的降解导致白血病细胞停止增殖，表达成熟髓系细胞表面标志物，并发生凋亡。

最关键的是，在白血病小鼠模型中，SPOP-bioPROTAC表达能显著延缓疾病进展，延长生存期，并减轻疾病严重程度。这一发现为将该策略推向临床应用提供了有力支持。

本研究主要采用了CRISPR-Cas9基因编辑筛选、蛋白质相互作用分析、体外和体内功能验证、生物分子凝聚体成像、转录组测序分析等技术方法。研究中使用了来自慕尼黑白血病实验室5000基因组计划数据库的临床样本数据，并建立了基因工程小鼠白血病模型进行体内疗效评估。

NUP98相互作用组包含参与蛋白质降解的因子

研究人员通过分析已发表的NUP98融合癌蛋白相互作用组数据，发现87个高置信度的稳定性调控因子，其中多数与三种以上NUP98融合癌蛋白相互作用。这些因子主要包括蛋白酶体亚基、E3连接酶、分子伴侣等，表明NUP98融合癌蛋白的相互作用网络富含蛋白质稳态相关因子。

NUP98::KDM5A稳定性受UPS调控

通过建立双荧光报告系统，研究人员证实NUP98::K5MA稳定性确实受UPS控制。抑制E1酶、neddylation或蛋白酶体活性均能提高NUP98::KDM5A稳定性，且上游抑制作用更为显著。转录组分析显示，NUP98::KDM5A表达会上调蛋白酶体通路基因，这一现象在不同模型中得到验证。

CRISPR-Cas9筛选鉴定NUP98::KDM5A稳定性的关键调控因子

阵列化CRISPR-Cas9筛选发现，35个基因的敲除能上调NUP98::KDM5A水平，其中14个编码蛋白酶体亚基。在9个E3连接酶中，7个的敲除能显著提高融合癌蛋白稳定性，其中SPOP缺失效应最为突出。在功能上，Spop敲除能促进白血病细胞增殖，类似于肿瘤抑制基因Trp53敲除的效果。临床数据进一步显示，NUP98-r AML患者SPOP表达下调，支持其肿瘤抑制功能。

E3连接酶SPOP是NUP98融合癌蛋白稳定性的直接调控因子

序列分析显示，NUP98 N端包含三个保守的SPOP降解基序。突变这些基序会增强NUP98::KDM5A稳定性，而SPOP与融合癌蛋白的结合依赖于其MATH结构域。药理抑制SPOP活性也能提高NUP98::KDM5A水平并促进细胞增殖，且这种效应依赖于融合癌蛋白的存在。重要的是，SPOP对多种NUP98融合癌蛋白均有调控作用，而对非NUP98-r AML细胞影响较小。

SPOP-bioPROTAC诱导NUP98::KDM5A完全降解

研究人员开发了基于SPOP、CRBN和VHL的三种bioPROTAC。其中，SPOP-bioPROTAC能在24小时内完全降解NUP98::KDM5A，而其他两种仅能实现部分降解。这种降解作用依赖于蛋白酶体活性，并导致核内致癌凝聚体消失。

SPOP-bioPROTAC诱导NUP98::KDM5A致癌凝聚体丢失和白血病相关转录程序

转录组分析显示，SPOP-bioPROTAC处理引起显著的基因表达变化，包括NUP98靶基因下调和髓系分化标志物上调。基因集富集分析证实，处理后的细胞表现出强烈的髓系分化特征。

SPOP介导的NUP98::KDM5A降解导致白血病母细胞终末分化并降低体内疾病负担

功能上，SPOP-bioPROTAC诱导细胞表达成熟髓系标志物，形态向终末分化转变，增殖停滞和凋亡。在动物模型中，SPOP-bioPROTAC表达能显著延缓疾病进展，延长生存期，并减轻疾病严重程度。

本研究首次将SPOP鉴定为NUP98-r白血病中的肿瘤抑制因子，揭示了其通过识别NUP98融合癌蛋白中的降解基序调控后者稳定性的新机制。研究开发的SPOP-bioPROTAC策略成功实现了NUP98::KDM5A的有效降解，并在临床前模型中验证了其治疗潜力。

这一研究的创新性在于发现不同E3连接酶在降解癌蛋白方面的功能不可互换性，强调基于天然底物-E3连接酶亲和力的PROTAC设计策略可能更具优势。SPOP对NUP98融合癌蛋白相对于正常NUP98的选择性降解，为靶向治疗提供了重要的安全窗口。

尽管当前研究依赖于GFP标记系统，但通过开发高亲和力结合剂识别非标记的NUP98融合癌蛋白，这一策略有望扩展到临床应用。此外，该研究为将靶向蛋白降解策略应用于其他难治性融合癌蛋白提供了概念验证和技术框架。

未来研究需要进一步阐明SPOP选择性降解NUP98融合癌蛋白的分子基础，开发适用于临床的递送系统，并探索该策略对其他NUP98重排的普适性。随着PROTAC技术的不断发展，基于内源性亲和力的降解策略有望为NUP98-r白血病及其他融合癌蛋白驱动肿瘤的治疗带来突破。