OCTN2钠离子依赖性肉碱转运的结构基础揭示脂肪酸代谢新机制

《Nature Communications》：Structural basis of sodium ion-dependent carnitine transport by OCTN2

本刊推荐：为解决OCTN2介导的高亲和力钠离子依赖性肉碱转运分子机制不明的问题，研究人员开展了人源OCTN2转运蛋白的冷冻电镜结构研究，成功解析其内向开放（配体游离/伊普拉铵结合）与闭塞（肉碱/Na+结合）三种构象，首次揭示了独立于底物结合腔的变构Na+结合位点及肉碱识别机制，为系统性原发性肉碱缺乏症（SPCD）的致病突变提供了结构解释，对理解脂肪酸代谢紊乱及相关药物研发具有重要意义。

　　

在细胞能量代谢的精密网络中，L-肉碱扮演着不可或缺的角色，它如同一位关键的调度员，负责将长链脂肪酸护送进入线粒体这座“细胞动力工厂”，进而通过β-氧化过程转化为生命活动所需的能量。人体内的肉碱主要来源于膳食，其细胞摄取高度依赖于一种名为新型有机阳离子转运蛋白2（OCTN2，由SLC22A5基因编码）的膜蛋白。OCTN2如同细胞膜上的一道专用闸门，以高亲和力、钠离子（Na⁺）依赖的方式，主动将细胞外的肉碱“泵”入细胞内。这种转运功能对于心脏、骨骼肌等高耗能组织的正常运作至关重要，同时在肾脏中负责重吸收绝大部分经肾小球滤过的肉碱，防止其流失。一旦OCTN2的功能因基因突变而受损，就会导致系统性原发性肉碱缺乏症（SPCD），这是一种可能致命的遗传病，患者常表现为心肌病、低血糖、肌无力等严重症状。

尽管OCTN2的生理重要性早已明确，但其如何精确识别肉碱，以及Na⁺如何驱动这一转运过程的分子机制，长期以来一直是领域内未解的核心问题。理解这一机制，不仅能揭示基本的生命过程，更能为SPCD的诊断和治疗提供新的视角。此外，OCTN2也被发现与克罗恩病等炎症性肠病的易感性相关，并能与多种药物分子发生相互作用，这使其在药学领域也备受关注。

为了揭开OCTN2工作机制的神秘面纱，James S. Davies、Yi C. Zeng等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用先进的冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了人源OCTN2在三种不同状态下的高分辨率结构：底物游离的内向开放构象、肉碱和Na⁺结合下的闭塞构象，以及药物分子伊普拉铵结合下的内向开放构象。这些结构如同三维分子“快照”，直观地展示了OCTN2的工作形态。

研究发现，OCTN2具有典型的主要协助超家族（MFS）折叠特征，由12个跨膜螺旋（TM）组成。最为关键的是，研究团队首次发现了一个独特的Na⁺结合位点。该位点位于蛋白质N端跨膜束内部的一个水相腔体中，由S28、N32（TM1）和N210（TM4）等残基协调，与肉碱结合腔相隔约10埃，表明Na⁺的结合是通过变构效应而非直接参与来调控肉碱的转运。在肉碱结合位点，研究观察到带负电的肉碱羧基与R471（TM11）形成关键的盐桥，而带正电的季铵基团则被Y239（TM5）、Y358（TM7）、F443（TM10）等芳香族残基形成的“芳香笼”所包裹，通过阳离子-π相互作用稳定。

为了验证结构观察到的功能位点，研究团队采用了双电极电压钳电生理技术。他们在非洲爪蟾卵母细胞中表达野生型和突变型hOCTN2，证实了肉碱转运是Na⁺依赖性的，并测定出肉碱的表观K_M值在低微摩尔范围（~12 μM），Na⁺的表观K_M值在低毫摩尔范围（~8.6 mM），符合生理条件下的饱和运作。对Na⁺结合位点残基（如N32A， N210A）进行突变后，肉碱的亲和力显著下降（K_M增加10余倍），有力地证明了Na⁺结合与肉碱结合的变构耦合。而肉碱结合关键残基突变（如R471A， Y358A）则导致转运功能几乎完全丧失，这与这些位点突变在SPCD患者中常见的结果一致。

研究还深入分析了OCTN2在不同构象间的转换机制。例如，在从闭塞构象向内向开放构象转变时，细胞内侧的R459（TM11）与E220（TM4）等残基形成门控网络；细胞外侧则有关键的D139（TM2）-Y482（TM11）氢键变化。TM1和TM11被识别为具有双重功能的关键螺旋，既参与离子结合/底物识别，也参与构象变化的门控调节。

此外，通过解析伊普拉铵（一种支气管扩张剂）与OCTN2结合的结构，研究发现该药物分子能够结合在肉碱口袋中，其季铵基团同样与“芳香笼”相互作用，但缺乏与R471的关键盐桥。功能实验表明，伊普拉铵并不被OCTN2有效转运，而是作为竞争性抑制剂发挥作用（IC₅₀ ~615 μM），这解释了为何OCTN2对肉碱具有高度选择性，而非广谱的药物转运体。

本研究主要应用了以下关键技术方法：利用BacMam病毒系统在HEK293F细胞中过表达人源OCTN2蛋白，通过亲和色谱与尺寸排阻色谱进行蛋白纯化，采用单颗粒冷冻电镜技术解析蛋白结构，并利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统结合双电极电压钳技术进行电生理功能验证。

结果

OCTN2的冷冻电镜结构解析

研究人员成功解析了OCTN2的三种构象，分辨率最高达2.7埃。结构显示OCTN2具有典型的MFS折叠，包含12个跨膜螺旋、一个细胞内螺旋结构域（ICH）和一个由二硫键稳定的细胞外结构域（ECD），ECD上存在三个N-连接糖基化位点。内向开放构象显示出一个巨大的溶剂可及腔体。

肉碱结合OCTN2闭塞结构定义了底物和钠离子结合位点

在肉碱和Na⁺结合的闭塞构象中，肉碱的羧基与R471形成盐桥，并通过水分子与Y447和Q207连接；其季铵基团被芳香族残基形成的笼状结构包围。Na⁺结合位点位于N端束的一个独立水腔中，由S28、N32、N210的氧原子及一个水分子以近似四方锥几何构型协调。该位点在底物游离的内向构象中也存在，表明Na⁺可能在该状态下仍结合。

电压钳电生理验证Na⁺和肉碱结合位点耦合

电生理实验证实hOCTN2介导Na⁺依赖的肉碱转运，动力学参数符合生理饱和特性。Na⁺结合位点突变（N32A， N210A）显著降低肉碱亲和力，证明变构耦合。肉碱结合关键残基突变（R471A， Y358A）导致功能丧失。研究还提出Q180和Q207双谷氨酰胺基序可能在耦合Na⁺和肉碱结合位点中起作用。

参与OCTN2闭塞至内向构象转变的门控残基

结构比较揭示了构象转变过程中的关键分子相互作用。包括细胞内侧由R459、E220、D165、R169等残基形成的门控网络，ICH结构域内R282-D519盐桥，以及细胞外侧D139-Y482氢键的形成/消失。TM1和TM11被强调为在构象变化和门控中起核心作用的螺旋。

伊普拉铵结合结构展示OCTN2如何结合带正电荷药物

伊普拉铵结合结构显示其季铵基团占据肉碱的铵基位置，但与R471无直接相互作用。该结构为内向开放构象，且伊普拉铵在功能上表现为抑制剂而非转运底物，突显了OCTN2对肉碱转运的特异性。

综上所述，这项研究通过结构生物学与功能实验相结合，首次揭示了OCTN2介导的Na⁺依赖性肉碱转运的分子机理。它不仅阐明了底物识别和离子耦合的精确细节，为理解SPCD相关致病突变提供了结构框架，而且修正了对OCTN2作为药物转运体角色的认识，强调其更倾向于一种高度特化的营养转运蛋白。该研究填补了SLC22 transporter家族乃至整个MFS超家族中Na⁺耦合转运机制的知识空白，对后续针对脂肪酸代谢紊乱疾病的药物开发和精准医疗具有重要的指导意义。