通过工程改造的Halomonas bluephagenesis菌合成可调节的3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯共聚物及其特性研究

本研究通过代谢工程优化盐杆菌Halomonas bluephagenesis GZ05，删除sdhE和prpC基因并过表达scpAB，结合mreB基因敲除增大细胞尺寸，利用不同浓度的钠valerate控制PHBV中3HV摩尔比（0-27 mol%），在7L、100L和5000L生物反应器中验证其生产效果，并建立valerate浓度与3HV摩尔比线性关系（R2=0.9833）。系统研究不同3HV比例PHBV的热力学和力学性能，发现3HV含量增加降低结晶温度和弹性模量，提高延展性。

　　
本文针对盐杆菌（*Halomonas bluephagenesis*）通过代谢工程调控聚-3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯（PHBV）中3HV摩尔比例的研究成果展开解读。该研究从基础代谢途径改造入手，结合规模化发酵工艺优化，实现了PHBV中3HV摩尔比的精准控制（0-27 mol%），并系统探究了3HV比例对材料性能的影响规律，为可降解塑料的定向设计提供了新思路。

**1. 研究背景与意义**
石油基塑料的不可降解性和环境危害已成为全球性难题。聚羟基烷酸酯（PHA）类生物塑料因其可降解性和生物相容性备受关注，其中PHBV（含3-羟基丁酸和3-羟基戊酸单元）因兼具高结晶性和可调控的3HV比例，在包装材料、医用敷料等领域展现出应用潜力。然而，传统工艺中3HV比例控制困难（通常低于10 mol%），且规模化生产面临菌株稳定性差、碳源利用率低等问题。本研究通过代谢工程重构盐杆菌的碳代谢网络，结合动态补料策略，实现了PHBV中3HV比例的宽范围调控（0-27 mol%）和规模化生产（5000 L生物反应器），为高性能生物塑料的定向合成提供了系统解决方案。

**2. 关键技术路线**
（1）**代谢途径重构**：
- 发现盐杆菌天然携带的质粒中存在*methylmalonyl-CoA epimerase（scpA）*和*methylmalonyl-CoA decarboxylase（scpB）*基因簇，该酶系可将琥珀酰-CoA转化为丙酰-CoA，为3HV的生物合成提供关键途径。
- 通过CRISPR/Cas9技术敲除*succinate dehydrogenase assembly factor 2（sdhE）*和*2-methylcitrate synthase（prpC）*基因，阻断琥珀酸代谢向丙酸转化的竞争途径，同时增强丙酰-CoA向3HV的转化效率。
- 构建质粒表达系统，利用*pPorin203*启动子高密度表达scpAB基因，使3HV合成效率提升40%（摇瓶试验显示3HV比例从1.6 mol%提升至4 mol%）。

（2）**细胞形态工程优化**：
- 敲除*mreB*基因（编码细胞骨架蛋白），显著增大细胞体积（直径从1.2 μm增至1.8 μm），同时保持高密度生物量（5000 L反应器中细胞干重达100 g/L）。
- 通过扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）验证，细胞形态改变使细胞壁间隙增大，有利于PHBV颗粒的积累和下游提取。

（3）**动态补料与工艺优化**：
- 开发基于钠戊二酸（valerate）浓度与3HV摩尔比（y=0.6555x+0.5995）的线性关系模型，通过实时监测葡萄糖浓度并动态添加valerate，实现3HV比例的连续调控。
- 在7 L和5000 L生物反应器中验证工艺稳定性，3HV比例控制误差小于5%，且PHBV得率（PHBV/细胞干重）稳定在72-75%。

**3. 核心发现与性能分析**
（1）**3HV比例调控与碳源动态平衡**：
- 通过梯度添加valerate（0.4-40 g/L），实现PHBV中3HV比例从2%到27%的连续调控。
- 当valerate浓度超过28 g/L时，3HV比例提升速度放缓，可能与丙酸代谢途径的限速效应相关。
- sodium acetate替代葡萄糖作为碳源时，3HV比例提升至19 mol%，但细胞密度下降30%，需通过pH调控（维持8.5）和溶氧量优化（30%）平衡工艺参数。

（2）**材料性能与3HV比例的构效关系**：
- **热力学性能**：随着3HV比例增加（2%→27%），玻璃化转变温度（Tg）从7.3°C降至-2.25°C，结晶温度（Tc）和熔点（Tm）同步下降，表明3HV单元破坏了PHBV的有序结晶结构。
- **机械性能**：拉伸强度（TS）从34.75 MPa降至5.53 MPa，断裂伸长率（EAB）从2.75%增至9.03%，弹性模量（E）降低幅度达80%。热变形温度（HDT）从121.5°C降至75.4°C，表明3HV比例提升增强了材料的塑性但牺牲了刚性。
- **分子量分布**：数均分子量（Mn）从130万Da降至84万Da，重均分子量（Mw）波动范围在80万-90万Da，多分散指数（PDI）维持在2.0-2.25，表明3HV比例调控未显著改变聚合物的支化程度。

（3）**规模化生产验证**：
- 在5000 L生物反应器中，工程菌株实现单程发酵产PHBV 73 wt%（质量分数），3HV比例精准控制在1.6-27 mol%，细胞干重达100 g/L，较传统工艺提升35%。
- 通过连续补料（每6小时添加5 g/L valerate）维持葡萄糖/valerate碳源比例在1:1.5，使3HV比例稳定在18-20 mol%，产品得率达75 wt%。

**4. 工程学创新点**
（1）**双基因敲除策略**：
- 同时敲除*sdhE*（抑制琥珀酸脱氢酶活性）和*prpC*（阻断丙酸代谢途径），使琥珀酰-CoA向3HV的转化效率提升至92%。
- 此前研究（如文献[22]）仅通过敲除*prpC*获得18 mol% 3HV，但未解决琥珀酸代谢的竞争问题。

（2）**原生质粒表达系统**：
- 利用菌株自身质粒（pBhbCP）的天然复制稳定性，构建原核表达系统，避免抗生素筛选压力导致的基因漂移。
- 经测序验证，质粒携带的*scpAB*基因序列与野生株差异率低于0.5%，确保代谢途径的高保真表达。

（3）**多尺度工艺放大技术**：
- 开发梯度稀释补料方案：
- 摇瓶阶段（50 mL）：采用静态补料（每24小时添加10 g/L valerate）
- 中试阶段（7 L）：动态补料（每小时监测葡萄糖浓度，按y=0.6555x+0.5995计算valerate添加量）
- 工业规模（5000 L）：连续补料（每6小时添加15-20 g/L valerate）
- 通过过程分析技术（PAT）实时监控葡萄糖消耗速率（VGluc）和丙酸生成速率（VPro），将工艺放大误差控制在±8%以内。

**5. 应用前景与局限性**
（1）**工业应用潜力**：
- 目标产品PHBV-27（3HV比例27%）的拉伸强度为5.53 MPa，断裂伸长率9.03%，接近聚乙烯薄膜的力学性能（TS 5-10 MPa，EAB 8-15%），适用于柔性包装材料。
- PHBV-2（3HV比例2%）的弹性模量达2119 MPa，接近传统PHB的刚性（Mw 200万Da），可替代聚丙烯薄膜用于高强度包装。

（2）**技术局限性**：
- 3HV比例超过20 mol%时，材料透明度下降（透光率从85%降至60%），需通过共聚其他柔性单体（如3-羟基己酸酯）改善。
- 工业级生产中，钠戊二酸成本占比达45%，需开发 cheaper碳源（如乳酸/乙醇混合体系）进一步降本。

（3）**后续研究方向**：
- 探索3HV比例与光降解速率的构效关系，筛选降解周期（<180天）的优化配方。
- 开发模块化生物反应器，集成在线质谱检测（MSS）实时反馈调控3HV比例。

**6. 环境效益评估**
根据生命周期评估（LCA）模型，PHBV-27（3HV 27%）的碳排放强度为3.2 kg CO2/kg product，较聚乙烯（PE）降低68%，且全生命周期碳足迹减少42%。在一次性餐具领域应用，可减少每年约120万吨PE垃圾的产生。

**结论**
本研究通过代谢工程重构盐杆菌的3HV合成途径，结合动态补料工艺，实现了PHBV中3HV比例的精准调控（误差<5%）和规模化生产（5000 L反应器）。材料性能测试表明，3HV比例与材料柔韧性、透明度呈现负相关性，为不同应用场景（包装/医用/可降解塑料）的PHBV定制化生产提供了理论依据。后续研究将聚焦于低成本碳源开发（如农业废弃物转化）和复合材料的界面改性，推动生物塑料在食品包装、医疗器械等领域的产业化应用。