简化细胞热位移检测方法以实现超高通量筛选

《SLAS Discovery》：Streamlining Cellular Thermal Shift assay for ultra-High Throughput Screening

细胞热转移试验（CETSA）技术优化及其在高通量药物筛选中的应用。通过开发等温CETSA加热平台和梯度Peltier设备（GPD），解决了传统方法在温度均匀性、检测灵敏度及实验步骤繁琐的问题。新方法支持 adherent细胞原位检测，利用Split NanoLuciferase技术实现高灵敏度读数，并通过熔解曲线分析验证化合物与靶点的结合特异性。实验表明，优化后的CETSA平台与荧光偏振法（FP）高度相关（r=0.71），并成功筛选出17β-雌二醇、LGD-4033等已知激动剂/拮抗剂，同时通过热成像验证了温度梯度控制的有效性。该技术为PROTAC分子等新型靶向化合物的高通量筛选提供了可靠工具，显著提升药物发现效率。

　　
在药物发现领域，高效筛选小分子与靶蛋白相互作用的方法至关重要。本文聚焦拜耳公司开发的细胞热转移测试（CETSA）技术优化方案，重点解决传统CETSA在高通量筛选中的三大瓶颈：细胞状态破坏、温度均匀性不足及假阳性率高。研究团队通过设备创新和实验流程优化，成功将CETSA技术整合至uHTS（超高通量筛选）体系，显著提升实验效率和结果可靠性。

### 一、技术背景与核心挑战
CETSA是一种基于蛋白质热稳定性的新型靶蛋白结合检测技术。当小分子与靶蛋白结合时，会增强蛋白质抵抗热变性能力，通过监测蛋白质在升温过程中的溶解特性，可间接反映结合强度。但传统CETSA方法存在显著局限：
1. **细胞状态破坏**：需将贴壁细胞转至悬浮状态进行热处理，破坏细胞原生微环境
2. **温度梯度控制差**：标准PCR仪难以均匀加热大尺寸微孔板，导致数据偏差
3. **假阳性率高**：约31%的已知无效化合物通过传统对照实验被误判为活性

### 二、核心创新与设备突破
#### 1. 等温CETSA平台的革新
- **双面加热架构**：采用上下两个独立温控模块（各含6组Peltier元件），确保微孔板均匀受热。热成像显示温度波动控制在±2.5℃以内
- **渐进升温策略**：以0.1℃/秒速率进行阶梯式升温（37℃→50℃），相比传统3分钟快速热激，显著减少边缘效应（温差＞5℃区域减少80%）
- **封闭式温控系统**：配备主动散热通道，使升温速率稳定在±0.02℃/秒，确保实验可重复性

#### 2. 梯度Peltier设备（GPD）开发
- **线性温度梯度生成**：通过不对称布局（3加热+3冷却Peltier元件），在1536孔板长轴方向形成45℃温差梯度
- **单板全流程操作**：整合样品制备、梯度加热（25-85℃）、冷却（20℃）及发光检测，减少转移步骤达60%
- **智能数据分析系统**：自动计算熔点温度（Tm），ΔTm值误差＜0.3℃（标准差0.26℃）

#### 3. 高灵敏度读数系统（Lumibox）
- **光纤光锥设计**：将微孔板底部光信号通过梯度光纤放大器（增益＞200倍）聚焦于CCD探测器
- **单次成像技术**：采用固定帧长曝光（20秒/板），相比传统EMCCD动态采样减少噪声干扰达40%
- **多通道并行检测**：支持同时读取32个微孔板（共49152孔），检测速度达传统设备的8倍

### 三、关键技术验证与性能对比
#### 1. 温度均匀性测试
- **传统方法**：使用PCR板时，边缘温差达±8℃（Sensoquest设备）
- **新平台表现**：等温CETSA设备温差＜2.5℃，梯度GPD长轴温差＜0.8℃/cm
- **热成像验证**：1500孔板三维温度分布显示中心区域温差＜0.3℃（图1B）

#### 2. 实验性能指标
| 指标 | 传统CETSA | 拜耳CETSA |
|-----------------|-----------|-----------|
| Z'因子（AR靶标） | 0.60 | 0.74 |
| S/B比（DHT处理）| 14.78 | 18.33 |
| 转移步骤 | 5次 | 1次 |
| 数据融合时间 | 30分钟 | 5分钟 |

#### 3. 靶标验证案例
- **雄激素受体（AR）**：成功识别17β-estradiol（ΔTm=+4.2℃）等8种已知激动剂，与荧光偏振法（FP）活性评分r=0.71高度吻合
- **SHP2磷酸酶**：通过梯度升温检测到分子胶SHP099（ΔTm=+3.5℃），而传统方法因温度梯度不足未能有效识别
- **CCNE1/CDK2比值**：OVCAR3细胞系显示5.2℃的Tm差异，验证了靶蛋白互作环境的重要性

### 四、方法学优化与临床应用
#### 1. 细胞培养模式革新
- **保留贴壁状态**：采用封闭式微孔板载体，避免传统胰酶消化导致的细胞骨架破坏
- **原代细胞适配**：成功应用于iPSC（诱导多能干细胞）来源的肿瘤细胞模型，维持细胞命运特征
- **规模化培养**：单板可承载2000个细胞（5μL体积），满足每周20万次高通量检测需求

#### 2. 质控体系升级
- **双模验证机制**：
- **等温验证**：通过未加热对照板（DMSO处理）排除非特异性信号（假阳性率从31%降至8%）
- **全熔解验证**：使用GPD设备进行ΔTm＞0.78℃的二次筛选，将假阳性率进一步降至2%
- **动态质控标准**：
- 空白板S/B比＞15（置信区间95%）
- 行间变异系数（Rel. SD）＜15%
- Tm值波动范围（3次重复）＜0.5℃

#### 3. 临床前应用验证
- **抗雄激素药物筛选**：成功识别Enzalutamide（Ki=87±14nM）等新型抑制剂，与已发表数据偏差＜10%
- **PROTAC化合物评估**：对BET（ bromodomain and extra-terminal motif）蛋白降解剂识别准确率达81%
- **毒性代谢物检测**：可区分化合物毒性（CYP450酶抑制率＞30%）与靶向活性

### 五、技术经济性分析
- **成本效益比**：
- 设备投入：约$500,000（含自动化接口）
- 每周检测能力：等温CETSA（1百万化合物/周），GPD二次验证（20万化合物/周）
- 单次检测成本：$0.012（含细胞培养、化合物稀释等）
- **时间效率**：
- 完整CETSA流程（含二次验证）耗时：4.5小时/批次
- 相较传统方法（6-8小时/批次）提升28%效率
- 梯度设备使样品处理量增加4倍（96孔→384孔兼容）

### 六、未来发展方向
1. **单孔全熔解检测**：研发微型化梯度加热模块（目标尺寸：384孔板单孔检测）
2. **人工智能辅助分析**：开发基于深度学习的Tm预测模型（当前准确率92%）
3. **多组学整合**：计划将CETSA与单细胞RNA测序结合，实现靶蛋白互作网络解析
4. **自动化扩展**：集成处理系统（如ARTAXS 8000），目标达成每天检测6个微孔板（约9.6万化合物）

本研究为药物发现提供了革命性工具：通过设备创新（双面加热/梯度Peltier）、方法优化（渐进升温/动态质控）和数据分析（自动Tm计算/ΔTm标准化），使CETSA技术成功从实验室级方法升级为GxP合规的工业级平台。该技术体系已成功应用于拜耳公司超过4百万化合物的uHTS项目，显著提升靶蛋白发现效率（从传统方法的0.1%提升至0.37%）。未来结合单细胞分析技术，有望在肿瘤微环境中实现更精准的靶蛋白互作研究。