甲胎蛋白通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路促进癌症多药耐药性研究

《Scientific Reports》：AFP promotes cancer multidrug resistance through activating PI3K/Akt/NF-κB signaling pathway

本研究针对癌症治疗中多药耐药(MDR)这一严峻挑战，深入探讨了甲胎蛋白(AFP)在调控癌细胞化疗敏感性中的新作用。研究人员通过基因操作结合生物信息学分析，发现AFP可通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，上调多药耐药蛋白(MDR1/MRP1/BCRP)和凋亡抑制蛋白(XIAP/cIAP1/Livin)表达，从而促进肝癌和宫颈癌的多药耐药性。该研究为逆转癌症化疗耐药提供了新的靶点和理论依据。

　　

在全球范围内，癌症始终是威胁人类健康的重大公共卫生问题，其中肝癌和宫颈癌因其高发病率和复杂的治疗方案而备受关注。尽管手术、化疗和放疗等治疗手段不断进步，但多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)的出现常常导致治疗失败、癌症复发和患者预后不良。多药耐药是指癌细胞对一种或多种作用机制不同的抗癌药物产生交叉耐受的现象，其机制复杂多样，包括药物靶点改变、药物外排增加、药物活性降低等。其中，ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)转运蛋白的过表达是导致经典多药耐药的关键机制之一。

甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)是一种在胚胎期由肝脏特异性合成的蛋白，在正常成人血清中水平极低。然而，在肝癌等恶性肿瘤进展过程中，血清AFP浓度会显著升高，使其成为评估肿瘤活性和复发的关键生物标志物。研究表明，AFP在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色，与癌细胞的增殖、转移、侵袭、凋亡抑制和免疫逃逸等多种生物学功能相关。虽然AFP在肿瘤进展中的作用已被广泛研究，但其在多药耐药中的具体角色和机制尚不明确。为此，冯思仁等人发表在《Scientific Reports》上的研究，旨在深入探索AFP在癌症多药耐药中的作用及其潜在的分子机制。

为了回答上述问题，研究人员开展了一项系统的实验研究。他们主要应用了以下关键技术方法：利用慢病毒载体构建AFP基因敲低（在Bel7402人肝癌细胞系中）和过表达（在HeLa人宫颈癌细胞系中）的稳定细胞株；通过MTT法和台盼蓝染色法检测细胞存活率和药物敏感性；采用克隆形成实验评估细胞长期增殖能力；使用TUNEL法检测细胞凋亡；通过蛋白质印迹法(Western Blotting)分析关键蛋白表达；借助免疫荧光技术观察蛋白定位；并利用LinkedOmics、GEPIA、DAVID等生物信息学数据库进行基因关联和通路富集分析。

AFP抑制癌细胞对药物治疗的敏感性

研究人员首先构建了稳定干扰AFP表达的Bel7402-shAFP肝癌细胞株和稳定过表达AFP的HeLa-AFP宫颈癌细胞株。MTT实验结果显示，沉默AFP可显著增强Bel7402细胞对阿霉素(ADM)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性，表现为细胞生长抑制率升高；而AFP过表达则降低了HeLa细胞对这两种化疗药物的敏感性。台盼蓝染色和克隆形成实验进一步证实，AFP干扰增强了药物诱导的细胞死亡并抑制了克隆形成能力，而AFP过表达则表现出相反的效果，促进了细胞在药物存在下的存活和增殖。

AFP表达对Bel7402和HeLa细胞凋亡及化疗敏感性的影响

TUNEL凋亡检测结果显示，在Bel7402细胞中，干扰AFP表达后，经ADM或5-FU处理的细胞凋亡特征（如核固缩、核碎裂）显著增加，TUNEL阳性细胞数增多。相反，在HeLa细胞中，AFP过表达则显著减少了药物诱导的凋亡细胞数量。这些结果表明，AFP可通过抑制凋亡途径来增强癌细胞的耐药性。

生物信息学分析AFP调控HCC和宫颈癌中的PI3K/Akt/NF-κB信号通路

生物信息学分析揭示，在肝细胞癌(HCC)中，AFP与PI3K/Akt/NF-κB信号通路的一些相关基因（如IKBKE、NFKB2、PIK3C3、PIK3CD、PIK3R2、PIK3R6、RELA）呈正相关。在宫颈癌中，AFP正相关基因显著富集于NF-κB信号通路、细胞粘附和生长激活因子等生物过程，并在PI3K/Akt信号通路中表现出显著富集。这提示AFP可能通过调节PI3K/Akt/NF-κB信号通路在癌细胞耐药中发挥作用。

AFP对HCC和宫颈癌细胞中PI3K/Akt/NF-κB信号通路激活的影响

实验验证表明，在Bel7402细胞中干扰AFP表达后，免疫荧光显示p65的核转位减少；Western Blotting检测到磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平显著降低，而总Akt和p65蛋白水平不变。使用PI3K抑制剂LY294002处理也能显著下调p-Akt和p-p65的表达。在HeLa细胞中，AFP过表达则显著增强了p65的核转位，并提高了p-Akt和p-p65的表达水平，LY294002处理同样能抑制该通路的激活。这些结果证实了AFP在两种癌细胞中均能激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路。

AFP对HCC和宫颈癌细胞中RELA(p65)介导的MDR和抗凋亡基因表达的调控作用

生物信息学分析显示，在HCC和宫颈癌中，RELA(p65)基因与ABC转运蛋白（ABCB1/MDR1, ABCC1/MRP1, ABCG2/BCRP）和抗凋亡基因（BIRC2/cIAP1, BIRC7/Livin, XIAP）的表达呈正相关。Western Blotting实验结果表明，在Bel7402细胞中干扰AFP表达后，MDR1、MRP1、BCRP、XIAP、cIAP1和Livin的蛋白表达水平均显著降低；LY294002处理也能产生类似效果。在HeLa细胞中，AFP过表达则显著上调了这些耐药和抗凋亡蛋白的表达，而LY294002处理可逆转这一效应。值得注意的是，在LY294002存在下，AFP过表达细胞中部分耐药蛋白（如BCRP、MDR1、Livin）的表达水平仍高于对照组，提示AFP可能还存在不完全依赖于PI3K/Akt通路的其他调控机制。

研究结论与讨论

本研究得出结论：AFP在癌细胞多药耐药中扮演着关键角色。其机制可能在于激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路，进而促进转录因子p65的核转位。核内的p65一方面可刺激多药耐药基因（如MDR1, MRP1, BCRP）的转录，增加化疗药物的外排；另一方面可促进抗凋亡基因（如XIAP, cIAP1, Livin）的表达，增强癌细胞的生存能力，从而共同导致多药耐药的发生。

这项研究的意义重大。它不仅首次在肝癌和宫颈癌两种不同的癌症模型中系统地证实了AFP是促进多药耐药的关键因子，还深入揭示了其作用的核心分子机制——通过激活PI3K/Akt/NF-κB信号通路来调控下游的耐药和抗凋亡网络。更重要的是，研究发现即使在使用PI3K抑制剂部分阻断通路的情况下，AFP过表达仍能维持一定水平的通路活性和耐药蛋白表达，这揭示了AFP介导的耐药网络存在复杂性和冗余性，为理解临床耐药现象的顽固性提供了新视角。该研究将AFP的功能从传统的生物标志物拓展到了调控癌细胞耐药性的关键信号分子，为未来开发针对AFP或其下游信号通路的联合治疗策略，以逆转癌症化疗耐药、提高治疗效果提供了重要的理论依据和新的思路。