基于特征的分子网络方法指导从Keetia venosa (Oliv.) Bridson叶片中分离山柰酚苷类化合物及其抗菌活性研究

《Physiotherapy》：Feature-based molecular networking-guided isolation of kaempferol glycosides from Keetia venosa (Oliv.) Bridson leaves and their antibacterial activity

本研究采用特征分子网络技术结合LC-MS/MS和NMR方法，对喀麦隆Keetia venosa叶中黄酮苷类化合物进行系统分离鉴定。共鉴定26种黄酮苷，成功分离12种，并发现其对抗多重耐药革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌）具有显著活性。该技术体系为热带植物中新型抗菌化合物的发现提供了高效解决方案。

　　

阿波利纳尔·凯内·东莫（Appolinaire Kene Dongmo）|埃里克·塔梅科·姆巴索（Eric Tameko Mbasso）|雷蒙德·恩甘索普·诺诺（Raymond Ngansop Nono）|加宾·蒂埃里·姆巴布·比查尼奥（Gabin Thierry Mbahbou Bitchagno）|阿卜杜·丘库阿（Abdou Tchoukoua）|马库斯·佩尔西克（Marcus Persicke）|布兰丁·坎帕-库姆康·恩肯福（Blandine Kampa-Kuemkon Nkenfou）|大卫·恩格诺卡姆（David Ngnokam）|佩潘·恩肯-埃富埃特·阿兰戈（Pépin Nkeng-Efouet Alango）|布鲁诺·恩贾库·伦塔（Bruno Ndjakou Lenta）|诺伯特·塞瓦尔德（Norbert Sewald）|让·罗多尔夫·舒纳（Jean Rodolphe Chouna）

喀麦隆江大学（University of Dschang）理学院化学系，邮政信箱67号

引言

内生真菌、植物和动物等生物以其丰富的化学多样性和生物活性而闻名。它们继续为药物发现中新型结构的开发提供模型（Shiono & Kimura, 2011; Zhang et al., 2015; Sezer et al., 2024）。尽管在天然产物（NPs）研究方面取得了显著进展，但健康挑战日益严峻，其中包括细菌感染，这已成为一个全球性的健康问题。最近的一项综述显示，在2019年大流行之前记录的1370万例感染相关死亡中，有770万例与33种细菌有关，占全球死亡总数的13.6%。发病率最高的五种病原体包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）（Global Burden Disease, 2022; Gnimatin et al., 2022）。多重耐药微生物（AMR）进一步加剧了这一负担，凸显了新型生物活性天然产物的需求。这得益于技术的进步，如基于质谱（MS）和核磁共振（NMR）的代谢组学，这些技术克服了基于天然产物的药物发现的一些传统障碍（Atanasov et al., 2021）。

Keetia属包含约40个已接受的物种，主要分布于非洲南部和热带地区，以攀缘植物为主。该属与Canthium和Psydrax属密切相关。Keetia的一个显著特征是它们的果实中的石质层（pyrenes），这些石质层覆盖着种子，并在中央形成一个完全或部分定义的盖状结构（Bridson, 1986）。文献表明，不同Keetia物种的多种植物部分，包括枝条、种子和叶子，已被用于传统医学中治疗细菌和寄生虫感染（Bero et al., 2011; Dongmo et al., 2020）。这些植物已被证实是多种代谢物的来源，主要包括萜类化合物、苯甲酸衍生物、香豆素和黄酮类化合物（Bero et al., 2013; Freire et al., 2019; Dongmo et al., 2020）。

黄酮类化合物是一类具有显著生物活性的化合物。它们作为治疗剂的潜力受到了广泛研究，在人类健康的多个领域取得了有希望的结果（Xiao, 2017）。从药理学角度来看，天然黄酮类及其合成衍生物具有多种活性，如抗氧化、抗癌、细胞毒性、抗炎、抗菌、抗真菌、抗疟疾、抗HIV、酶抑制和抗神经退行性作用（Xiao, 2017; Donkia et al., 2022; Nchiozem-Ngnitedem et al., 2023; Tsamo et al., 2024）。黄酮类的抗菌活性与其骨架上的特定化学结构密切相关，例如对革兰氏阳性细菌有效的芳基取代基，而它们对革兰氏阴性病原体的作用仍知之甚少（Yan et al., 2024）。

在之前对Keetia物种的化学研究中，研究人员鉴定出一种A型双连接原花青素三聚体以及来自Canthium venosum（Oliv.）Hiern（同义词：K. venosa）果实的多种其他原花青素（Dongmo et al., 2020）。然而，这些植物器官中的黄酮类型及其完整成分谱尚未明确。本报告采用基于特征的分子网络引导的分馏方法，对K. venosa叶子的极性提取物中的黄酮苷进行了全面分析。所采用的方案包括LC-MS/MS分析、构建植物成分的全球分子网络、通过NMR分离和鉴定选定的植物成分，以及评估它们对热带地区常见细菌的抗菌效果。基于特征的分子网络工作和全球网络是在GNPS2（Global Natural Products Social Molecular Networking）平台上建立的，这是一个提供样本数据集尽可能多化学信息的集成在线平台（Aron et al., 2020）。

小节片段

去重复

甲醇（MeOH）叶粗提物被分离成二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtOAc）和-丁醇（-BuOH）提取物。每种提取物的浓度为1 mL/mg，并通过数据依赖性采集（DDA）模式的LC-MS/MS进行分析，使四种最丰富的离子通过碰撞诱导解离（CID）进一步碎片化。结果特征被比较以确定相似性，相似度得分高的离子被分组形成分子

结论

总之，基于特征的分子网络方法有助于从K. venosa的甲醇粗提物中分离黄酮醇苷。分析结果鉴定出26种黄酮衍生物，其中12种被分离出来。所采用的方法在黄酮的去重复和靶向分析方面非常高效。此外，抗菌筛选的结果令人鼓舞，因为革兰氏阴性细菌表现出显著的

一般实验程序

开管色谱使用Merck硅胶（0.04-0.063 mm）进行分馏，使用0.063-0.200 mm硅胶进行纯化。分析TLC使用预涂铝背硅胶60 F₂₅₄片。尺寸排阻色谱使用Sephadex LH-20进行。中压液相色谱（MPLC）使用Flashpure select正常相硅胶柱，柱径25-40 μm，在Büchi色谱系统Pure C-815 Flash上进行。洗脱溶剂

CRediT作者贡献声明

马库斯·佩尔西克（Marcus Persicke）：方法学、研究、概念化。阿卜杜·丘库阿（Abdou Tchoukoua）：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。大卫·恩格诺卡姆（David Ngnokam）：验证、监督。布兰丁·坎帕-库姆康·恩肯福（Blandine Kampa-Kuemkon Nkenfou）：方法学、研究。布鲁诺·恩贾库·伦塔（Bruno Ndjakou Lenta）：撰写——审稿与编辑、项目管理、资金获取。佩潘·恩肯-埃富埃特-阿兰戈（Pépin Nkeng-Efouet-Alango）：验证、监督、概念化。让·罗多尔夫·舒纳（Jean Rodolphe Chouna）：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念化。

未引用的参考文献

Zhang et al., 2014.

数据可用性

LC-MS/MS数据已提交至MassIVE数据库存储库（http://massive.ucsd.edu），基于特征的分子网络分析结果可在GNPS2平台上获取，网址为：https://gnps2.org/status?task=f4a49b24d13e486a9c5b049b389619bf。

资助

作者感谢DAAD通过雅温得-比勒费尔德研究生院（YaBiNaPA项目N? 57561808）和Alango基金会（喀麦隆江大学非洲医学参考医院）提供的财政支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们衷心感谢比勒费尔德大学生物技术中心（CeBiTec）、NMR和质谱部门的帮助。作者还感谢比勒费尔德大学的开放获取出版基金，该基金资助了文章的处理费用（APCs）。A.K.D.感谢比勒费尔德青年研究员基金提供的职业发展博士——博士后研究机会。B.N.L.也对该基金表示衷心的感谢。