红光与直流电场协同调控三维神经细胞培养中神经突生长的作用机制及功能成熟研究

《Scientific Reports》：Combined effects of red light and direct-current electric fields on neurite growth in 3D neural cell cultures

本研究针对三维神经细胞培养中神经突生长导向与功能成熟难题，创新性地将红光照射与直流电场刺激相结合，系统探究了两种物理因子在人类和小鼠神经母细胞瘤三维培养模型中的协同效应。研究人员通过优化刺激参数发现联合干预可显著促进神经突定向延伸，RNA测序揭示神经肽Y及其受体介导该过程，电生理记录证实联合刺激诱导神经元产生重复放电活动。该研究为神经再生修复提供了新型非侵入性联合治疗策略。

　　

在大脑和脊髓损伤等神经系统病变中，神经元轴突的再生修复是功能恢复的关键。然而，成年哺乳动物中枢神经系统的再生能力极为有限，如何有效促进神经突生长并引导其正确延伸方向，成为神经再生医学领域的重大挑战。传统二维细胞培养模型虽为研究提供了便利，但其扁平化的生长环境与体内三维微环境存在显著差异，难以真实模拟神经元的空间生长特性。因此，在更接近生理条件的三维培养体系中探索有效的神经突生长促进策略，具有重要科学意义和临床转化价值。

目前，光生物调节和电刺激作为两种非侵入性物理干预手段，在神经再生领域展现出应用前景。红光照射通过激活线粒体细胞色素c氧化酶，提升细胞能量代谢并调控活性氧水平，进而促进神经突生长；而直流电场则能通过引导细胞极化和离子流动，为神经突延伸提供方向性线索。尽管两种方法在二维培养中均已证实有效，但它们在三维环境中的协同效应及作用机制尚不明确。

为解决这一问题，发表在《Scientific Reports》的这项研究首次系统探讨了红光与直流电场联合刺激对三维神经细胞培养中神经突生长的协同促进作用。研究团队通过精确优化刺激参数，结合多组学分析和功能验证，揭示了两种物理因子协同作用的新机制，为开发神经再生联合治疗策略提供了实验依据。

关键技术方法包括：构建1 mg/mL胶原蛋白三维培养体系实现细胞均匀分布；采用盐桥系统产生稳定直流电场(175-350 mV/mm)；使用625 nm红光发光二极管进行照射(2 mW/cm²)；通过免疫荧光染色和神经元形态定量分析评估神经突生长；采用RNA测序筛选关键基因通路；应用全细胞膜片钳技术记录神经元电生理活动。

优化直流电场与红光刺激参数增强神经突生长

研究人员首先在三维胶原凝胶中培养SH-SY5Y和N2a细胞，系统优化直流电场和红光刺激参数。结果显示，SH-SY5Y细胞在175 mV/mm电场刺激3小时时神经突生长最显著，而N2a细胞在350 mV/mm刺激2小时效果最佳。红光照射参数优化表明，2 mW/cm²强度照射45小时可最大程度促进两种细胞的神经突延伸，更高强度(5 mW/cm²)则导致光毒性效应。活性氧检测证实红光照射使细胞内活性氧水平提高约4倍，表明线粒体活性增强。

联合刺激增强三维培养中神经突生长

将优化参数应用于联合刺激实验，发现直流电场与红光协同作用产生最显著的神经突生长促进效果。神经突取向分析显示，联合刺激组神经突沿电场方向排列程度最高(<|cosθ|>=0.76)，显著高于对照组(0.48)。神经突长度定量分析表明，联合刺激使SH-SY5Y和N2a细胞神经突长度分别增加约150%，效果显著优于单一刺激。

RNA测序识别神经肽Y为关键介质

转录组分析发现，联合刺激显著上调神经活性配体-受体相互作用通路基因表达。进一步筛选鉴定出神经肽Y在联合刺激组表达上调最为显著，提示其可能介导神经突生长促进效应。

神经肽Y受体抑制验证功能重要性

使用神经肽Y Y1和Y2受体特异性抑制剂处理，发现两种受体抑制均显著减弱联合刺激诱导的神经突生长，证实神经肽Y信号通路在介导物理刺激效应中的必要性。

电生理功能成熟评估

电生理记录显示，联合刺激组SH-SY5Y细胞表现出重复放电活动，而对照组无电生理响应，表明联合刺激不仅促进形态学成熟，还诱导功能性离子通道发育和神经元兴奋性建立。

研究结论表明，红光与直流电场联合刺激通过互补机制协同促进三维培养中神经突生长和功能成熟：红光通过激活线粒体功能增强细胞能量代谢，直流电场提供空间导向线索；神经肽Y信号通路关键介导此过程。该研究首次在三维培养模型中系统阐明光学与电刺激联合应用的协同效应及分子机制，为神经再生治疗提供了新思路。虽然存在细胞模型和培养体系简化等局限性，但这种非侵入性联合刺激策略展现出良好的临床转化前景，未来在原发性神经元和体内模型中的验证将进一步推动其向临床应用迈进。