1p36.23/ENO1位点遗传变异调控血液CD34+细胞水平的GATA2依赖性机制解析

《Scientific Reports》：Functional dissection of the gene regulatory mechanism underlying variation in blood CD34+ cell levels at 1p36.23/ENO1

本研究针对影响外周血CD34+造血干/祖细胞（HSPC）水平的1p36.23位点遗传关联机制不明的问题，通过功能精细定位，发现rs10864368:C>T是非编码因果变异。该T等位基因通过破坏GATA2转录因子结合位点，降低ENO1和RERE基因表达及CD34+细胞水平，揭示了GATA2在人类造血调控中的新靶点，为干细胞动员和移植提供了新见解。

　　

在干细胞移植领域，从外周血中采集足够数量的CD34⁺造血干细胞和祖细胞（HSPC）是成功的关键。然而，不同个体间血液中CD34⁺细胞的基线水平存在显著差异，这直接影响着干细胞动员和采集的效率。理解这种差异背后的遗传调控机制，不仅有助于优化临床治疗方案，更能为干细胞生物学提供新的洞见。

此前，一项针对13,167名瑞典人的全基因组关联研究（GWAS）发现了11个与血液CD34⁺细胞水平显著相关的遗传位点。其中一个最强的信号落在了人类1号染色体短臂的1p36.23区域，该区域位于ENO1（烯醇化酶1）和RERE（精氨酸-谷氨酸二肽重复序列）基因之间。ENO1是糖酵解途径中的关键酶，而RERE则是视黄酸受体的转录共激活因子。虽然研究通过表达数量性状位点（eQTL）分析和染色质构象捕获（Hi-C）数据推测该区域的遗传变异可能通过调控ENO1和/或RERE的表达来影响HSPC，但由于该区域存在17个高度连锁的遗传变异，真正的因果变异及其具体作用机制一直是个谜。为了揭开这个谜团，由Zain Ali和Bjorn Nilsson等人组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果，对1p36.23位点进行了深入的功能性解析。

为了开展研究，研究人员主要运用了几项关键技术：利用公共数据库（如GEO和ENCODE）获取原发性血液细胞（包括CD34⁺ HSPC）的ATAC-Seq（测定转座酶可及染色质的高通量测序）和ChIP-Seq（染色质免疫沉淀测序）数据，用于分析染色质可及性和转录因子结合；使用荧光素酶报告基因实验在K-562细胞（一种天然对目标变异杂合的白血病细胞系）中测试候选变异对基因转录活性的影响；采用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过单一向导RNA（sgRNA）在K-562细胞中删除包含目标变异的关键调控区域，并利用qPCR（定量聚合酶链反应）检测下游基因表达变化；运用生物信息学工具（如PERFECTOS-APE和JASPAR数据库）进行转录因子结合 motif（模序）分析，预测变异对转录因子结合的影响。

rs10864368是1p36.23关联的潜在因果变异

研究人员首先从17个连锁变异中筛选出两个（rs10864368和rs2065603）位于原发性HSPC（如造血干细胞HSC、共同髓系祖细胞CMP、共同淋巴样祖细胞CLP）染色质开放区域的候选者。随后的荧光素酶报告基因实验显示，携带rs10864368-C等位基因（该等位基因与较高的CD34⁺细胞水平相关）的构建体其转录活性显著高于携带T等位基因的构建体，而rs2065603的两个等位基因则未显示出活性差异。为了进一步验证该调控元件的功能，研究团队利用CRISPR/Cas9技术在K-562细胞中删除了包含rs10864368的区域。结果显示，删除该区域后，ENO1基因的表达显著下降，而RERE基因的表达未发生显著变化，这与先前观察到的ENO1具有更强eQTL效应的结果一致。此外，对来自7名杂合供体的原发性CD34⁺细胞的DNase-Seq（脱氧核糖核酸酶I超敏位点测序）数据分析发现，在rs10864368位点存在显著的等位基因失衡，即染色质可及性明显偏向于C等位基因。这些证据共同将rs10864368锁定为最可能的因果变异。

rs10864368-T等位基因破坏GATA2结合并降低染色质可及性

接下来，研究人员探究了rs10864368影响基因表达的分子机制。通过motif分析，他们预测rs10864368-T等位基因会破坏GATA2转录因子的经典结合 motif。计算结合效率的结果显示，C等位基因的结合效率比T等位基因高出2,012倍。GATA2在造血干/祖细胞生物学中扮演着至关重要的角色。利用公共的ENCODE ChIP-Seq数据，研究人员在天然杂合的K-562细胞中分析了GATA2在rs10864368位点的结合情况，发现了极其显著的等位基因失衡，GATA2结合强烈偏向于C等位基因。这表明在天然基因组环境中，rs10864368-T确实削弱了GATA2的结合能力。研究人员还追踪了GATA2以及其他相关因子（如GATA1和SMAD1）在该位点结合的动态变化，发现GATA2的结合会随着HSPC向红细胞分化而消失，且SMAD1（一种响应BMP信号的转录因子）也会短暂结合该位点，提示该调控元件可能整合了谱系决定因子（GATA2）和信号通路（BMP）的信息。

rs10864368的多效性表型关联

为了探索rs10864368更广泛的生物学意义，研究人员检索了GWAS数据库。他们发现，rs10864368-C等位基因不仅与较高的CD34⁺细胞水平相关，还与较高的中性粒细胞计数、血小板计数等髓系细胞指标呈正相关，而与淋巴细胞百分比呈负相关。此外，该等位基因还与较低的内在表观遗传年龄加速相关。这些关联性暗示，增强的GATA2结合可能通过促进髓系祖细胞（如CMP）的扩增，进而影响整体造血平衡，甚至可能与干细胞衰老过程存在联系。

研究结论与讨论

本研究通过系统的功能分析，揭示了1p36.23位点影响血液CD34⁺细胞水平的分子机制：rs10864368-T等位基因通过破坏GATA2转录因子的结合，降低了局部染色质可及性，进而导致ENO1和RERE基因表达下调，最终影响HSPC的数量。这项研究将特定的GATA2靶点与CD34⁺细胞水平的遗传调控联系起来，拓展了我们对GATA2在人类造血中作用的认识。

同时，作者也指出了研究的局限性，例如使用K-562细胞系作为HSPC模型的局限性，以及CRISPR编辑策略未能通过测序直接验证编辑效率等。未来需要在原代HSPC中进行更精确的基因编辑（如基于同源定向修复或碱基编辑）来进一步确认rs10864368的功能，并排除其他连锁变异贡献的可能性。

关于下游机制，ENO1作为糖酵解酶，其表达变化可能影响HSPC的能量代谢平衡，而能量代谢已知在HSPC功能中起关键作用。RERE作为视黄酸信号的调控因子，其在动物模型中也显示出对HSPC数量的影响。因此，ENO1和RERE均是合理的候选基因，它们如何具体影响HSPC生物学特性将是未来研究的重要方向。此外，rs10864368与表观遗传年龄加速的关联，为探索干细胞功能与衰老之间的联系提供了有趣的线索。

总之，这项研究不仅阐明了1p36.23位点遗传变异的调控机制，也为改善干细胞移植策略和理解人类造血生理提供了新的理论基础。