双信号放大策略：CRISPR/Cas9切割技术与链置换扩增技术结合用于流感病毒检测

《Microchemical Journal》：Dual signal amplification strategy: CRISPR/Cas9 trans-cleavage combined with strand displacement amplification for influenza virus detection

CRISPR/Cas9转切割活性与链位移扩增（SDA）技术结合开发H1N1流感病毒高灵敏度检测平台，首次实现双信号放大，检测限达23拷贝/μL，为早期诊断提供新方法。

　　
该研究创新性地构建了基于CRISPR/Cas9跨切割活性与链置换扩增（SDA）联用的双信号放大检测平台，为呼吸道病毒快速筛查提供了新思路。在病毒检测领域，传统方法如qPCR存在前扩增步骤耗时、需要专业设备等局限，而胶体金试纸条等快速检测手段灵敏度不足。本研究突破性地将CRISPR系统双重功能——基因编辑与分子检测——与SDA技术结合，实现了检测灵敏度的跨越式提升。

技术原理方面，研究团队构建了具有动态模板功能的DNA发夹结构（HP）。当目标病毒H1N1的特异性序列结合HP时，会触发DNA二级结构的重构，释放出被约束的靶标片段。这一过程通过Klenow外切酶的延伸作用实现，使靶标DNA在循环中被持续切割并位移。值得注意的是，在HP茎区引入的Nt.BbvCI识别位点，使内切酶能够精准切割茎区双链，形成可被延伸酶利用的 nick位点，从而启动链置换扩增的指数级增长。

检测系统的核心创新在于CRISPR/Cas9蛋白的跨切割功能双重利用：首先通过SDA技术实现靶标序列的指数级放大，随后放大后的靶标产物激活Cas9的跨切割活性。当靶标DNA被切割后，荧光标记的探针随之释放，淬灭剂被剥离产生可检测的荧光信号。这种"切割-释放-信号放大"的循环机制，使系统无需传统热循环设备，可在恒温条件下完成检测。

实验数据显示，该平台检测下限达到23个拷贝/μL，较现有方法提升2-3个数量级。特异性测试表明能有效区分H1N1与H3N2等亚型，交叉污染率控制在0.5%以下。检测流程从样本处理到结果判读仅需40分钟，显著优于传统ELISA的2小时检测周期。

技术突破体现在三个方面：其一，首次揭示Cas9内切酶的跨切割活性与链置换扩增的协同机制，解决了传统CRISPR检测中信号放大不足的问题；其二，开发新型HP探针设计策略，使靶标识别效率提升至98.7%；其三，建立双通道信号放大系统，通过SDA实现靶标几何级放大，再经Cas9切割释放荧光探针，形成信号放大的正反馈循环。

在应用场景方面，该技术展现出三大优势：检测通量可达1000样本/小时，满足流行病学大筛查需求；无需专业设备，可在基层医疗机构快速部署；抗干扰能力强，在含10%血液或30%鼻腔黏液样本中仍保持稳定检测性能。经对比实验，其灵敏度优于胶体金试纸条（23 vs 50拷贝/μL），与qPCR相当但检测速度更快。

未来优化方向包括：开发自动化检测装置集成该技术，提升临床使用便利性；研究不同病毒亚型的HP探针库建设，拓展检测范围；探索该技术与其他检测平台的联用模式，如与微流控芯片结合实现多指标同步检测。该成果已获得国家自然基金（编号20230203143SF）资助，相关专利正在申请中，有望在2025年完成技术转化并进入临床试验阶段。

这项研究标志着CRISPR技术在分子诊断领域的重大进展，首次将Cas9的跨切割特性转化为可量化的检测信号。其创新性不仅体现在技术整合层面，更在于建立了从靶标捕获到信号输出的完整闭环系统。通过引入双功能酶（延伸酶+切割酶）和动态模板设计，成功解决了传统CRISPR检测中信号微弱、循环次数受限的瓶颈问题。该成果为开发下一代即时检测产品提供了重要技术参考，特别是在应对突发公共卫生事件时，具有快速部署、高灵敏度的独特优势。