通过快速化学衍生化及冰浴-起泡辅助盐析萃取技术，结合窄口径高效液相色谱-紫外光谱分析，对食品和癌细胞中的多胺进行定量测定

《Microchemical Journal》：Quantification of polyamines in foods and cancer cells through rapid chemical derivatization and ice-bath-effervescence-assisted salting-out extraction followed by narrow-bore HPLC-UV analysis

本研究采用4-二甲基氨基-1-萘基异硫氰酸酯（DNITC）作为衍生化试剂，结合微波辅助（300W，5min）和冰浴下酸碱反应产生的CO2气泡协同盐析效应，高效提取多胺（Put, Spd, Spm）。检测限达0.1μM，灵敏度较传统方法提高400-700倍，成功应用于16种食物及6种癌细胞系的PA定量分析，为临床和膳食监测提供新策略。

　　

陈文荣|廖芳仪|李佳阳|翁静如|冯佳贤

台湾高雄医科大学药学院毒理学硕士课程，高雄80708

摘要

过量摄入多胺（PA），包括腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm），会加速癌细胞的增殖和迁移。在本研究中，使用4-二甲基氨基-1-萘基异硫氰酸酯作为衍生化试剂，并采用微波辅助衍生化（300 W，5分钟）方法将PA与良好的显色团标记结合。衍生化后，加入质子供体（柠檬酸）和发泡盐（KHCO₃）。在中和反应中，通过在冰浴条件下生成CO₂来实现同时的盐析效应和发泡现象。低温的使用提高了盐析效果和发泡效果，从而在不需辅助设备的情况下提高了提取效率，使提取过程在三分钟内完成。定量线性范围为1–200 μM，腐胺、亚精胺和精胺的检测限分别为0.3、0.1和0.1 μM。该研究成功定量了16个食品样本和六种癌细胞系中的PA含量，其灵敏度比使用未衍生化PA的方法提高了400–700倍。这一改进为临床和饮食监测提供了重要潜力。

引言

多胺（PA），如腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm），可以通过内源性（体内合成）和外源性途径进入人体，其中外源性途径更为普遍。在哺乳动物细胞的尿素循环中，前体鸟氨酸在一系列酶（例如鸟氨酸脱羧酶、亚精胺合成酶和精胺合成酶）的作用下形成PA [1,2]，随后由Spd/Spm N¹-乙酰转移酶代谢并从细胞中排出 [3]。在健康人体中，PA在细胞生长、免疫、迁移和基因调控中起重要作用 [1]。此外，它们还参与抗衰老、抗氧化和抗糖基化等生理活动 [4], [5], [6]。然而，在癌症患者中，PA的合成和代谢受到癌基因的影响。具体来说，癌基因失衡导致癌细胞中PA积累增加，从而促进其增殖和迁移 [7,8]。近年来，已经开发出多种针对PA生成代谢途径的治疗药物，如二氟甲基鸟氨酸 [9]。一些研究表明，将二氟甲基鸟氨酸与低PA饮食结合可能是有效的癌症治疗方法 [10]。因此，对食品中PA的定量分析可以为癌症患者提供有价值的参考数据。

由于PA具有阳离子烷胺的结构特性，通常需要对其进行衍生化处理以提高检测灵敏度并改善其在反相柱中的保留能力。在以往的分析方法中，常用磺酰氯作为衍生化试剂 [11], [12], [13]，其中丹磺酰氯使用最为频繁。值得注意的是，当反应溶液的pH值保持在7到8之间时，异硫氰酸酯试剂不会与铵离子、氨基酸或碳水化合物发生反应，从而提高了选择性和衍生物的稳定性 [14]。在我们的方法中，使用4-二甲基氨基-1-萘基异硫氰酸酯（DNITC）作为衍生化试剂，并以乙腈（ACN）水溶液作为反应介质，这有助于异硫氰酸酯向氨基的亲核加成。同时，在衍生化过程中施加微波加热，ACN水溶液有效吸收了微波能量，从而加快了反应速度。

液-液萃取 [11,15,16]、分散液-液微萃取 [17,18] 和固相萃取 [13,19] 常被用作净化方法。近年来，绿色分析化学技术有助于节约能源、减少有毒有机溶剂的使用并降低废物产生 [20]。盐析辅助液-液萃取通过添加电解质（例如盐）来降低亲水性有机溶剂在水溶液中的溶解度，形成两相系统。含有分析物的上层有机相可以直接通过反相色谱进行分析 [21,22]。因此，盐析辅助液-液萃取提供了一种简单、方便、经济且有效的分析策略 [23]。传统的萃取方法通常需要辅助设备（如涡流混合器或超声装置）来分散样品溶液中的萃取溶剂 [24]。因此，近年来发泡辅助萃取受到了广泛关注。这种方法通过原位酸碱反应生成无毒的CO₂，可以自发增加萃取剂与样品溶液之间的接触面积，无需辅助设备 [25], [26], [27]。此外，Molaei等人 [28] 报告称，加入冰浴可以生成持续时间较长的细小CO₂气泡，从而提高萃取效率。

由于食品样本的复杂基质，必须对其进行预处理以去除蛋白质和其他分子。在我们的方法中，使用碱性溶液作为蛋白质沉淀剂，同时为后续的衍生化提供了碱性环境。冷冻-解冻方法中，冰晶的形成会破坏细胞结构并导致细胞内物质渗出，从而提高萃取效率 [29,30]。此外，还应用微波能量加速PA的DNITC衍生化。随后，在低温条件下向反应溶液中加入盐，进行冰浴-发泡辅助盐析萃取（IEA-SOE）。最后，使用窄口径高效液相色谱（HPLC-UV）分析食品样本和癌细胞系中的PA含量。

化学品和试剂

腐胺（Put）购自Fluka（德国Steinheim）。硫酸铵（(NH₄)₂SO₄、1,6-二氨基己烷（内标IS）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）由Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）提供。柠檬酸、正辛烷、正癸烷和DNITC购自东京化学工业（日本东京）。三乙胺（TEA）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP）来自Alfa Aesar（英国兰开夏）。氯化铵（NH₄Cl）购自昭和化学工业（日本东京）。最后，使用的是ACN。

微波辅助衍生化和IEA-SOE

在本研究中，微波辅助衍生化与传统加热方法的不同之处在于它利用偶极极化和离子传导来诱导加热。这使得反应混合物能够直接受热，从而加速衍生化反应并提高能源效率。为了评估每个反应参数的影响，将衍生物与内标的最大峰面积比定义为100%的衍生化效率。本研究使用DNITC作为衍生化试剂。

结论

本研究开发了一种结合微波辅助衍生化和IEA-SOE的方法，用于测定食品和癌细胞系样本中的PA含量。优化的微波辅助衍生化条件为300 W，持续5分钟。IEA-SOE利用质子供体和发泡盐进行酸碱中和反应，生成二氧化碳气泡并同时产生盐析效应。值得注意的是，冰浴创造了低温环境，进一步增强了

CRediT作者贡献声明

陈文荣：撰写——原始草稿、验证、方法学。廖芳仪：撰写——原始草稿、方法学。李佳阳：资源准备。翁静如：监督、资金获取。冯佳贤：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家科学技术委员会（资助编号：NSTC 113-2113-M-037-010和NSTC 114-2113-M-037-002）以及国立中山大学-高雄医科大学联合研究项目（资助编号：NSYSU-KMU-114-P21）提供的财政支持。