《The Journal of Molecular Diagnostics》：A More Clinically Effective Long-Read Sequencing-Based Approach for Comprehensive Analysis of Spinal Muscular Atrophy
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本研究开发CASMA2，一种基于长读测序的SMA筛查方法，结合Poisson分布与内参基因B2M，有效检测SNVs、插入/缺失及2+0静默携带者。通过414份回顾性样本和303份前瞻性样本验证，其SMA1/2 CN分析准确率达100%，首次尝试成功率分别为99.0%和98.7%，为临床筛查提供高效精准方案。
李书媛|刘白玲|张静帆|唐宁|华仁义|杨金玲|黄星星|李浩贤|毛爱萍|陈丽宝|黄继伟|王彦琳
上海交通大学医学院国际和平妇产儿童健康医院，中国上海
传统的脊髓性肌萎缩症（SMA）筛查方法在检测SMN1/2单核苷酸变异（SNVs）及小插入和缺失、SMN1 2+0静默携带者以及SMN2的拷贝数（CN）方面存在挑战。为了解决这些问题，研究人员开发了一种基于长读长测序（LRS）的技术，称为SMA综合分析（CASMA2）。CASMA2通过结合泊松分布和内源性参考基因来进行CN分析，这是首个为LRS平台开发的此类方法。使用414份回顾性外周血样本和303份前瞻性干血斑样本对CASMA2的性能和临床可行性进行了评估。结果显示，CASMA2在SMN1/2 CN分析中的准确率为100%，并成功识别了SMN1/2中的SNVs/插入和缺失。此外，通过家族三联体单倍型分析，CASMA2还能够筛查SMN1 2+0静默携带者。在长期外周血样本中，首次尝试的筛查成功率为99.0%（414例中的410例）；在干血斑样本中，该成功率为98.7%（303例中的299例）。因此，CASMA2提供了一种临床可行、精确且高效的SMA携带者和新生儿筛查方法。
研究参与者
共分析了来自335个无关中国家庭的414份外周血基因组DNA样本。这些样本包括316名非携带者、81名携带者和17名通过CASMA确诊的SMA患者。对于因单倍型信息不足而CASMA结果不确定的样本，通过qPCR、多重连接依赖性探针扩增或下一代测序技术进行了验证。此外，还分析了303份前瞻性DNA样本（这些样本来自干血斑）。
CASMA2对SMN1/2的CN分析
CASMA2通过基于泊松分布的模型，并结合内源性参考基因B2M进行SMN1/2的CN分析（见图1B和2A）。例如，样本SMA0084具有三种不同的SMN1单倍型和两种不同的SMN2单倍型，因此其SMN1的拷贝数为3，SMN2的拷贝数为2；样本SMA0014含有1个SMN1拷贝和3个SMN2拷贝，这三个SMN2拷贝具有相同的单倍型，其CN通过读深度分析得到确认（见图2A）。讨论
本研究介绍了CASMA2的开发过程，这是一种用于分析人类基因组中最复杂且具有临床重要性的区域（即SMN1/2区域）中的CN、SNVs/插入缺失以及SMN1 2+0静默携带者的综合方法。分析过程中使用了PCR扩增技术和PacBio系统生成覆盖所有SMN1/2外显子的片段。CASMA2还同时对内源性参考基因B2M进行测序，从而实现了更准确的CN分析并缩短了分析时间。这是目前已知的首个此类方法。
披露声明
J.Z.、A.M.和L.C.是Berry Genomics公司的员工。致谢
感谢所有参与本研究的受试者。
作者贡献
Y.W.和J.H.提出了研究方案并设计了实验流程；Y.W.、J.H.、S.L.、B.L.和J.F.撰写了初稿；S.L.、B.L.、J.Z.、A.M.和L.C.负责样本准备、数据采集、分析及解读；N.T.、R.H.、J.Y.、X.H.、H.L.和A.M.对文章进行了修订。
