单细胞RNA测序揭示了副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）对抗氨苄西林时存在的异质性生存策略

《Journal of Memory and Language》：Single-cell RNA seq reveals heterogeneous survival strategies of Vibrio parahaemolyticus against ampicillin

单细胞RNA测序揭示副溶血性弧菌ampicillin耐药性亚种群异质性机制，发现外排泵、蛋白质稳态、毒力调控等关键功能亚群，为精准抗生素开发提供新靶点。

　　

张希功|周宇|鲍永兵|杨瑶|潘英杰|赵勇|刘海泉

上海海洋大学食品科学与技术学院，中国上海201306

摘要

批量RNA测序（Bulk RNA-Seq）仅能捕捉细菌群体的平均基因表达水平，在分析细菌亚群体之间的功能差异方面存在局限性。因此，本研究创新性地应用了基于液滴的单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，以解析副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）中的氨苄西林耐药性异质性。研究结果表明，高水平的耐药性（MIC = 1000 μg/mL）对所关注表型有显著影响，尤其是在考虑亚抑制浓度时。通过scRNA-seq，研究人员鉴定出了具有特定功能的细胞亚群体，例如由gorA上调介导的氧化应激防御亚群体、通过exsD抑制III型分泌系统实现的毒力调节亚群体、由MATE家族外排泵赋予的耐药性亚群体、由Hsp20维持的蛋白质稳态亚群体，以及由pspA上调促进的膜损伤修复亚群体。表型异质性分析结果支持了一些新发现的功能注释，揭示了细菌在抗生素压力下的生物学基础。这些耐药性亚群体的发现为深入理解副溶血性弧菌的耐药性提供了新的见解，并为开发针对关键信号蛋白的新型抗菌策略奠定了基础。

引言

副溶血性弧菌是一种常见的海洋源性食源性病原体，对人类健康构成威胁。当人们摄入被这种细菌污染的生食或未充分煮熟的水产品时，可能会导致胃肠道疾病（Su和Liu，2007）。副溶血性弧菌通过多种机制表现出毒力，包括黏附素、毒素和III型分泌系统（T3SS）（Zhang和Orth，2013）。该菌已成为重要的海洋病原体，是导致食源性急性胃肠炎的主要原因，并对全球公共卫生产生日益严重的影响（Velazquez-Roman等，2014）。2010年至2020年的11年间，中国每年平均报告523.5例副溶血性弧菌感染病例（Chen等，2017；Zheng等，2025）。

如今，由于抗生素的广泛使用，抗生素耐药基因（ARGs）的获得和传播变得十分普遍（Guo等，2025；Lemée等，2025）。多项研究表明副溶血性弧菌具有多重耐药性（Huan等，2018；Jiang等，2014；Li等，2019；Tan等，2022；Xiaofeng等，2023）。特别是副溶血性弧菌通过减少亲水性孔蛋白（如OmpF）的表达和降低对β-内酰胺类抗生素（如氨苄西林）的摄取来增强耐药性（Munita Jose和Arias Cesar，2016；Tan等，2022），这正是本文研究的重点。

下一代测序（NGS）有助于研究细菌的耐药性。转录组测序揭示了外排转运蛋白在链霉素耐药性中的关键作用（Zhang等，2024）。对暴露于氨苄西林的副溶血性弧菌的转录组分析表明，包括VPA0510和VPA0252在内的九个基因的过表达增强了其对氨苄西林的耐药性（Tan等，2022）。在Vp2015094菌株中，与LuxS/AI-2群体感应系统相关的luxS基因对抗生素耐受机制和耐药性决定因子的水平传播均具有重要贡献（Jiang等，2023）。

然而，由于技术限制，针对单个细菌的细胞表达异质性的研究较为罕见。批量RNA测序只能反映细菌群体的平均基因表达水平，无法检测到丰度低于1%的稀有细胞亚群体。相比之下，scRNA-seq能够高分辨率地解析复杂微生物群落的细胞异质性，分析细胞类型及其相关的基因表达差异，并识别潜在的新治疗靶点（Wang等，2025；Hedlund和Deng，2018；He等，2023）。Xu等（Xu等，2023）报道了一种可用于检测单个细菌转录组表达图的技术。Ma等（Ma等，2023）通过scRNA测序发现，群体内的异质性主要由促进抗生素耐药性进化的移动遗传因子的表达驱动。scRNA-seq为我们提供了一种方法，用于探索副溶血性弧菌的耐药性异质性。通过研究单个细菌的适应性和相互作用，我们旨在阐明细菌持续存在和耐药性的机制，识别耐药性亚群体，开发针对副溶血性弧菌感染的新诊断和治疗策略，并为研究人员提供一种新的分析方法。

实验部分

细菌培养

实验使用了从上海医院胃肠科的一名急性腹泻患者中分离出的副溶血性弧菌菌株VP49（以下简称VP49），该菌株携带毒力基因簇tdh⁺/trh⁺/tlh⁺。该菌的遗传特征已在我们实验室的先前研究中进行了全面描述（Li等，2017）。冷冻保存的菌株经过解冻后，通过硫硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖培养基进行分离

最低抑菌浓度（MIC）和生长异质性

药物敏感性测试显示，VP49菌株对氨苄西林的MIC为1000 μg/mL，远高于CLSI Vibrio耐受标准（≥32 μg/mL），表明该菌株已形成了对氨苄西林的强耐药性表型。结合相关文献数据，推测这可能与携带同源耐药基因（如新型β-内酰胺酶基因blaV110或类似酶系统）有关（Chiou等，2015）

结论

本研究通过scRNA-seq揭示了VP49在氨苄西林胁迫环境下的适应机制。通过将scRNA-seq与表型分析相结合，我们发现细菌在亚抑制抗生素压力下的存活是由专门的细胞群落协调实现的，而非均匀适应。关键的是，表型异质性的变化得到了解释：显著的运动能力抑制与exsD介导的T3SS抑制作用密切相关

讨论

VP49观察到的异常高氨苄西林耐药性（MIC = 1000 μg/mL）与全球弧菌β-内酰胺类抗生素耐药性上升的趋势一致，这一点在上海的水产品中得到了验证（Xiao等，2023；Yu等，2016）。这种耐药性与由移动遗传元件驱动的抗菌耐药基因（ARGs）的积累有关（Fang等，2023）。例如，运动能力的显著抑制（图1C-D）直接与exsD的作用相关

CRediT作者贡献声明

张希功：撰写初稿、可视化、验证、方法学设计。周宇：验证、调查、正式分析、概念构建。鲍永兵：方法学设计、调查、概念构建。杨瑶：监督、软件应用、方法学设计。潘英杰：验证、项目管理、数据整理、概念构建。赵勇：方法学设计、数据整理、概念构建。刘海泉：撰写与编辑、监督、资金筹集、数据整理

利益冲突声明

本研究得到了上海农业应用技术研发计划（项目编号：X2024-02-08-00-12-F00038）的支持。