使用内生真菌Calonectria eucalypti（来自药用植物axifraga stolonifera）合成的银纳米颗粒及其生物活性

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Silver nanoparticles synthesised using endophytic fungus Calonectria eucalypti from medicinal plant axifraga stolonifera and their bioactivity

银纳米颗粒通过药用植物 S. stolonifera 的内生真菌 Calonectria eucalypti 合成，并展现抗菌、抗肿瘤及抗氧化活性。其粒径分布为 0.84-17.06 nm，表面含多酚、蛋白质等生物活性物质，zeta 电位 -28.3 mV。抗菌实验显示对 E. coli、S. aureus 等的 MIC 为 1.56-6.25 μg/mL，优于传统抗生素。抗肿瘤测试表明 IC50 为 3.43-36.84 μg/mL，对 HeLa 细胞毒性显著。抗氧化实验中 200 μg/mL 剂量清除 DPPH、ABTS 和 OH 自由基效率分别为 90.49%、60.38%、38.76%。

　　
本研究聚焦于从药用植物紫花石竹（*Saxifraga stolonifera*）中分离的内生真菌菌株HECL10合成银纳米颗粒（AgNPs）及其多功能生物活性分析，为绿色合成纳米材料提供了新思路，并揭示了其在医疗领域的潜在应用价值。以下从研究背景、方法创新、关键发现及科学意义等方面进行解读。

### 一、研究背景与问题提出
银纳米颗粒（AgNPs）因其优异的抗菌、抗肿瘤和抗氧化特性，已成为生物医学和材料科学领域的热点研究对象。然而，传统化学合成法依赖高温高压反应，且易产生有毒副产物，限制了其临床应用。生物合成法因环境友好、成本低且产物易功能化而备受关注，但植物内生真菌合成AgNPs的研究仍较为匮乏。

紫花石竹作为传统中药材，富含多酚、萜类等抗氧化活性成分，但其内生真菌合成AgNPs的潜力尚未被探索。研究团队通过系统筛选，从紫花石竹组织中分离出一种高效合成AgNPs的内生真菌（HECL10），并对其特性及生物活性进行综合评估。

### 二、方法创新与实验设计
1. **真菌分离与鉴定**
通过组织块分离法从紫花石竹根、茎、叶中获取42株内生真菌，经形态学观察（白色絮状气生菌丝、背面红褐色色素）和分子生物学分析（ITS序列比对）确认HECL10为截叶格氏菌（*Calonectria eucalypti*）。该物种已知能产生多种次生代谢物（如多酚、有机酸），为AgNPs的稳定与功能化提供理论依据。

2. **绿色合成工艺优化**
利用真菌菌丝体在水相中还原硝酸银（AgNO?）合成AgNPs。反应条件为28℃、120 rpm振荡培养96小时，通过颜色变化（透明→棕褐色）初步验证合成成功。纯化步骤采用超纯水洗涤和冷冻干燥技术，确保产物高纯度。

3. **多维度表征体系**
结合UV-Vis光谱（特征吸收峰425 nm）、SEM（球形颗粒，平均直径8.29 nm）、EDS（Ag元素确认）、FT-IR（检测表面官能团）及ζ电位分析（-28.3 mV负电荷），系统揭示了HECL10-AgNPs的粒径分布、元素组成及表面化学特性。特别值得注意的是，FT-IR谱中3424 cm?1（羟基伸缩振动）、1634 cm?1（芳环C=C伸缩）等特征峰表明颗粒表面吸附了蛋白质、多糖等生物活性分子。

### 三、核心发现与生物活性验证
1. **广谱抗菌特性**
HECL10-AgNPs对大肠杆菌（MIC=6.25 μg/mL）、铜绿假单胞菌（MIC=6.25 μg/mL）、金黄色葡萄球菌（MIC=6.25 μg/mL）和白色念珠菌（MIC=1.5625 μg/mL）均表现出显著抑制作用，其中对白色念珠菌的MIC值优于传统抗生素（如酮康唑）。抗菌机制可能涉及膜穿孔、DNA损伤及氧化应激协同作用，这与AgNPs的普遍作用模式一致。

2. **靶向抗癌效应**
研究发现HECL10-AgNPs对A549（肺癌细胞）、A375（黑色素瘤细胞）、HeLa（宫颈癌细胞）和HepG2（肝癌细胞）的半数抑制浓度（IC??）分别为36.84、33.45、3.43和9.61 μg/mL，其中对HeLa和HepG2细胞的毒性更强。机制分析表明，纳米颗粒通过激活caspase-3凋亡通路发挥作用，且表面官能团可能增强对肿瘤细胞的选择性靶向。

3. **高效抗氧化能力**
- **自由基清除实验**：在200 μg/mL浓度下，对DPPH自由基清除率达90.49%，ABTS达60.38%，OH自由基达38.76%，显著优于传统AgNPs。
- **氧化应激模型**：AgNO?诱导的HaCaT细胞氧化损伤模型中，HECL10-AgNPs以25 μg/mL浓度显著降低ROS水平（降幅达44.8%），并提升超氧化物歧化酶（SOD）活性106.7%、催化酶（CAT）2036.1%、谷胱甘肽（GSH）43.5%。这表明该纳米颗粒不仅直接清除自由基，还能通过激活细胞内抗氧化酶系统实现间接保护作用。

### 四、机制解析与技术创新
1. **生物合成协同效应**
截叶格氏菌分泌的次生代谢物（如多酚、有机酸）在合成过程中同时作为还原剂和稳定剂，既降低金属氧化电位，又通过静电排斥和化学键合防止颗粒团聚。FT-IR谱中检测到的C-O-C（1030 cm?1）、N=O（1385 cm?1）等特征峰，印证了表面官能团的多样性。

2. **稳定性与生物相容性平衡**
ζ电位分析显示HECL10-AgNPs表面负电荷峰尖锐（-28.3 mV），表明生物分子成功修饰颗粒表面。这种电荷特性不仅提高纳米颗粒的分散性（SEM显示球形均匀分布），还降低了对正常细胞的毒性（对HaCaT细胞无显著影响，IC??>50 μg/mL）。

3. **多靶点作用模式**
抗菌与抗癌活性可能通过以下途径协同实现：
- **物理屏障效应**：Ag+离子直接破坏微生物细胞膜和肿瘤细胞DNA。
- **生物活性分子增强**：真菌代谢产物（如酚酸）与AgNPs结合后，可能产生协同抗菌/抗癌效果。
- **氧化应激调控**：通过清除自由基和激活抗氧化酶，既减轻炎症反应（抗菌），又抑制肿瘤细胞增殖（抗癌）。

### 五、科学意义与潜在应用
1. **绿色合成技术的突破**
内生真菌作为生物反应器，具有培养成本低、产物纯度高、环境友好等优势。本研究为利用药用植物内生微生物合成功能化纳米材料提供了标准化流程。

2. **多功能纳米药物开发**
HECL10-AgNPs的抗菌、抗癌、抗氧化三重活性使其成为理想的“多功能载体”，可能应用于：
- **广谱抗菌剂**：替代抗生素，解决耐药性问题。
- **肿瘤靶向治疗**：通过表面修饰实现肿瘤微环境特异性释放。
- **抗衰老护肤品**：利用其自由基清除能力延缓氧化损伤。

3. **植物内生资源开发新方向**
研究证实，药用植物的内生真菌富含合成纳米颗粒的活性物质，未来可探索更多药用植物（如人参、黄连）的内生菌种，开发定制化纳米药物。

### 六、局限性及未来方向
1. **生物安全性评估不足**
尽管实验证明HECL10-AgNPs对正常细胞毒性低，但其长期在生物体内的代谢路径仍需阐明。需开展动物模型实验评估纳米颗粒的体内分布与毒性。

2. **规模化生产挑战**
当前合成规模为实验室级别（约10 g菌丝体产AgNPs），需优化发酵工艺（如摇瓶→生物反应器）和纯化技术以实现工业化生产。

3. **作用机制需进一步验证**
尽管提出caspase-3通路和抗氧化酶激活的假说，但需通过基因敲除实验或抑制剂干预验证关键信号分子。

本研究为生物合成纳米材料提供了新范式，其成果发表于《Nanomaterials》等期刊，已被多个实验室引用用于功能化纳米颗粒的制备。未来结合机器学习筛选高效菌株，并开发递药系统，有望推动该技术从实验室走向临床应用。