IL-12通过激活TREM2/DAP12通路增强小胶质细胞吞噬功能改善糖尿病视网膜神经变性

《Molecular Neurobiology》：IL-12 ameliorates diabetic retinal neurodegeneration by activating microglial phagocytosis via the TREM2/DAP12 pathway

本研究聚焦糖尿病视网膜病变（DR）早期神经变性（DRN）这一关键病理环节，探讨了白细胞介素-12（IL-12）的治疗潜力及作用机制。研究人员通过构建糖尿病小鼠模型和高糖培养的BV2小胶质细胞模型，结合转录组测序等技术，发现玻璃体内注射IL-12能有效减轻视网膜神经节细胞（RGCs）损伤，其神经保护作用是通过激活JAK-STAT信号通路，上调髓系细胞触发受体2（TREM2）及其衔接蛋白DAP12的表达，从而增强小胶质细胞的吞噬功能来实现的。该研究为早期DR的干预提供了新的潜在治疗靶点。

　　

糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）是糖尿病最常见且严重的微血管并发症之一，已成为全球工作年龄成年人视力丧失的主要原因。目前的临床治疗手段，如视网膜激光光凝、玻璃体切除术和药物治疗，对于大多数已进展至中晚期的患者效果有限，因为此时的视网膜神经损伤往往已不可逆转。近年来，越来越多的证据表明，糖尿病视网膜神经变性（Diabetic Retinal Neurodegeneration, DRN）实际上早于血管病变发生，并在DR的早期发展中扮演着核心角色。其中，视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）作为视神经病变中的主要病理细胞，其结构和功能的完整性对DRN的进展至关重要。因此，深入探究RGC损伤的机制，并寻找能够延缓或阻止早期DR进展的有效策略，具有重大的临床意义。

在中枢神经系统中，及时清除受损或死亡的细胞对于维持健康的神经网络至关重要，这一任务主要由小胶质细胞（Microglia）的吞噬功能（Phagocytosis）承担。作为视网膜常驻的先天免疫细胞，小胶质细胞通过动态分支和伸展监视并调节视网膜微环境，参与突触修剪，支持突触发育和可塑性，在免疫应答、视网膜神经组织发育及维持内环境稳态中发挥关键作用。在早期DR中，RGCs发生变性和死亡，其细胞内容物释放到周围环境中，这会激活炎症免疫通路，破坏血-视网膜屏障，并加剧视网膜细胞损伤。因此，寻找能够增强小胶质细胞功能的药物，对于抑制早期DR进展、保护视功能具有重要的临床价值。

白细胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）是一种由树突状细胞、巨噬细胞等抗原呈递细胞产生的异源二聚体细胞因子，由p35和p40两个亚基通过二硫键连接而成。凭借其强大的抗血管生成和免疫激活特性，IL-12已被广泛应用于临床抗肿瘤治疗。近年来，其神经保护作用逐渐受到关注。例如，重组人IL-12 p80被证实可增强少突胶质细胞分化并促进轴突再生，有助于受损坐骨神经的功能恢复。在糖尿病大鼠模型中，玻璃体内注射纳米颗粒负载的IL-12能通过下调血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）和基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9, MMP-9），显著抑制视网膜新生血管形成，同时恢复神经节细胞层（Ganglion Cell Layer, GCL）的厚度。这些发现提示，IL-12可能是治疗早期DRN的潜在药物，但其对小鼠DRN的具体作用及机制尚不清楚。

发表在《Molecular Neurobiology》上的这项研究，旨在利用体内糖尿病小鼠模型和体外高糖小胶质细胞模型，结合转录组测序技术，探讨IL-12治疗在早期DR进展中的作用及其分子机制，为寻找早期DR的潜在治疗靶点提供科学依据。

主要技术方法概述

本研究采用了多种关键技术方法。在体内实验中，使用6-7周龄C57BL/6雄性小鼠，通过连续5天腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin, STZ，50 mg/kg）并结合高糖高脂饮食诱导糖尿病模型。成功建模7周后，对糖尿病小鼠进行玻璃体内注射PBS（DM组）或IL-12（DM+IL-12组）。通过苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin, HE）染色和免疫组织化学/免疫荧光染色评估视网膜结构厚度和小胶质细胞（标记物为IBA-1）等的表达与分布。利用视网膜组织进行转录组测序（RNA-seq），进行差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）、KEGG和GO富集分析。在体外实验中，使用BV2小胶质细胞系，在高糖（45 mM）条件下给予不同浓度IL-12处理，通过流式细胞术和免疫荧光法检测其吞噬FITC标记荧光微球的能力，并通过蛋白质印迹法（Western Blotting, WB）和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析相关蛋白和基因表达。此外，还整合分析了公共数据库中的STAT4染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）数据。

研究结果

IL-12改善糖尿病小鼠早期视网膜神经变性

研究首先证实了糖尿病模型的成功建立，与对照组（CON）相比，糖尿病（DM）组小鼠体重显著降低，血糖水平显著升高。免疫荧光染色显示，IL-12受体β1（IL-12RB1）在DM组小鼠视网膜中，尤其是在GCL层，有清晰表达。HE染色结果显示，糖尿病导致视网膜神经纤维层（Nerve Fiber Layer, NFL）、GCL和总视网膜厚度显著变薄，而IL-12治疗显著逆转了这种变薄，表明IL-12对早期DRN具有保护作用。同时，研究发现在此早期阶段，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平与对照组相比无显著升高，且IL-12处理也未引起这些细胞因子的显著变化，提示IL-12在此背景下并未引发明显的炎症反应。

生物信息学分析揭示小胶质细胞和吞噬通路富集

转录组测序分析发现，与CON组相比，DM组有366个基因上调，3个基因下调；而与DM组相比，DM+IL-12组有477个基因上调，25个基因下调。KEGG通路富集分析显示，CON与DM组间的差异表达基因（DEGs）显著富集于补体和凝血级联、吞噬体、细胞因子-细胞因子受体相互作用等通路。而DM与DM+IL-12组间的DEGs则显著富集于抗原加工和呈递、NOD样受体信号、吞噬体以及细胞粘附分子等通路。值得注意的是，吞噬通路是唯一在两个比较中均位列前五的富集通路。GO分析也得出了类似的功能富集结果。维恩图分析显示，有75个DEGs在DM组中表达发生变化，并可被IL-12部分逆转，这些基因主要在小胶质细胞和未受刺激的巨噬细胞中表达，相关通路涉及细胞外基质组织和蛋白质磷酸化的正调控。免疫组化结果进一步证实，正常小鼠视网膜中小胶质细胞数量少且呈分支静止态，而DM和DM+IL-12组中小胶质细胞数量增多且呈阿米巴样活化形态。这些结果提示，DR状态和IL-12治疗可能通过影响小胶质细胞的活化状态来调节其吞噬功能。

IL-12增强高糖环境下小胶质细胞的吞噬功能

为在细胞水平验证IL-12对小胶质细胞吞噬功能的影响，研究使用了BV2小胶质细胞系。免疫荧光证实了小胶质细胞表达IL-12受体。通过使用FITC标记的荧光微球评估吞噬功能，免疫荧光和流式细胞术分析均一致表明，高糖（HG）条件显著抑制了小胶质细胞的吞噬能力，而IL-12处理则能部分恢复其吞噬功能。此外，IL-12在高糖条件下促进了小胶质细胞的增殖，但对其迁移能力无显著影响。

IL-12通过JAK-STAT-TREM2信号通路激活小胶质细胞吞噬功能

IL-12主要通过经典的STAT4磷酸化通路发挥作用。蛋白质印迹结果证实，IL-12干预虽未改变小胶质细胞内总STAT4蛋白水平，但显著提高了其磷酸化STAT4（p-STAT4）的水平。为进一步阐明IL-12激活STAT4后如何调控吞噬相关基因，研究人员整合分析了IL-12刺激的自然杀伤（NK）细胞的STAT4 ChIP-seq数据、小鼠视网膜RNA-seq上调的DEGs以及GSEA数据库中的237个胞葬作用（Efferocytosis）相关基因，最终筛选出33个IL-12-STAT4信号直接调控的下游候选基因。RT-qPCR验证发现，IL-12处理后，TREM2、IRF8、CYBA、CORO1A、TGM2、ITGAM和NCKAP1L等7个基因的表达显著上调，其中TREM2的上调尤为显著。细胞水平的蛋白质印迹也证实了IL-12能增加TREM2的蛋白表达。

IL-12提高糖尿病小鼠视网膜中TREM2和DAP12的水平

体内实验进一步验证了上述机制。RT-qPCR和蛋白质印迹结果显示，与DM组相比，DM+IL-12组小鼠视网膜中TREM2和DAP12的mRNA及蛋白水平均显著升高。免疫组化染色表明，TREM2和DAP12主要表达于视网膜GCL层，与微glia的典型定位一致，且IL-12处理显著增加了视网膜中TREM2阳性和DAP12阳性细胞的数量。

研究结论与意义

本研究证实，在糖尿病早期，玻璃体内注射IL-12能够减轻视网膜神经层的变薄，对DRN发挥神经保护作用。其核心机制在于：IL-12通过激活小胶质细胞膜上的IL-12受体，启动胞内JAK-STAT信号通路，特别是促进STAT4的磷酸化；活化的STAT4进而转录上调TREM2及其共适配器DAP12的表达；TREM2/DAP12信号通路的激活最终增强了小胶质细胞的吞噬功能，使其能够更有效地清除凋亡的RGCs，从而抑制因死亡细胞残留所引发的炎症反应，保护周围健康的视网膜神经元，延缓早期DR的进展。

该研究首次揭示了IL-12在糖尿病视网膜病变早期通过调控小胶质细胞功能发挥神经保护作用的新机制，将IL-12的免疫调节功能与中枢神经系统的胞葬作用联系起来，为理解DRN的发病机制提供了新的视角。研究所明确的JAK-STAT-TREM2/DAP12信号轴，为开发针对早期DR的靶向治疗策略提供了潜在的分子靶点。虽然研究存在一些局限性，例如未能直接证明TREM2下调与吞噬功能受损的因果关系，缺乏在体的吞噬功能直接证据以及更全面的视网膜功能评估（如视网膜电图），但无疑为IL-12作为早期DR治疗药物的转化研究奠定了重要的理论基础。未来研究可进一步探索优化IL-12的递送方式，评估其长期疗效和安全性，并深入验证TREM2/DAP12通路在该过程中的核心地位。