铜绿假单胞菌在不同生境下的全基因组进化选择压力分析

《NAR Molecular Medicine》：Genome-wide evolutionary selection pressures acting on Pseudomonas aeruginosa residing in different environments

本研究针对囊性纤维化（CF）患者气道与环境来源的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是否存在差异进化选择压力这一关键问题，开发了一种无模拟的dN/dS分析模型。通过对国际假单胞菌联盟数据库（IPCD）中483株分离株进行全基因组分析，研究人员发现206个开放阅读框（ORF）在两类分离株中呈现差异选择信号，并揭示代谢分支点酶在CF气道适应中受到显著富集的选择压力。该研究为理解病原菌在特定宿主环境中的适应性进化提供了新的视角和方法。

　　

在微生物与宿主相互作用的漫长演化史中，病原菌如何适应特定宿主环境始终是进化生物学和感染医学的核心议题。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种典型的机会性病原体，既能广泛存在于自然环境中，又是囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者肺部感染的主要致病菌。当环境菌株入侵CF患者气道后，它们会经历剧烈的适应性演化，但这种适应过程的基因组层面特征，特别是自然选择作用的具体模式，尚未被系统揭示。传统研究多聚焦于识别"致病适应性"（pathoadaptive）基因突变，却难以区分哪些基因是维持定植所必需，哪些仅是伴随现象。

为解决这一难题，剑桥大学的研究团队在《NAR Molecular Medicine》发表了创新性研究。他们开发了一种无需模拟计算的dN/dS分析模型，能够以单密码子分辨率精准量化选择压力，同时容忍基因插入/缺失（indel）和基因丢失事件。研究团队对国际假单胞菌联盟数据库（IPCD）中367株CF来源和116株环境来源的铜绿假单胞菌分离株进行全基因组比对，以标准菌株PAO1为参考基因组，采用滑动窗口法计算每个开放阅读框（ORF）的dN/dS值（非同义替换率与同义替换率的比值）。通过设定dN/dS<0.73为负向选择（纯化选择）、0.73-1.36为中性漂变、>1.36为正向选择的阈值标准，系统识别了不同生境下的差异选择信号。

关键技术方法包括：1）从IPCD数据库获取483株CF与环境来源菌株的全基因组数据；2）基于Muse-Gaut算法的dN/dS计算模型，结合滑动窗口分析实现单密码子分辨率；3）通过STRING数据库和k-means迭代聚类进行功能富集分析；4）将选择信号映射至KEGG代谢通路图和AlphaFold预测的蛋白质结构；5）采用Wilcox秩和检验统计验证代谢分支点酶的富集显著性。

CF与环境分离株的基因组特征

通过多位点序列分型（MLST）和系统发育分析证实，研究所用菌株具有广泛的地理分布和多系起源特征，排除了单一流行株主导结果的可能性。CF与环境分离株在系统发育树上呈多系分布，表明适应性进化独立发生于多个遗传背景。

全基因组选择压力格局

在PAO1基因组5586个ORF中，约96%呈现强烈的负向选择信号，说明核心基因组在不同生境下高度保守。然而，373个ORF表现出非负向选择特征，其中206个在CF与环境分离株间呈现显著差异选择模式。火山图分析进一步识别出530个具有显著差异的ORF（p<0.1），包括在CF分离株中保守而在环境分离株中易变的297个"致病适应性"ORF，以及在环境分离株中保守而在CF分离株中易变的233个"环境适应性"ORF。

代谢分支点酶的特异性选择

通过KEGG通路映射发现，差异选择信号显著富集于代谢分支点反应。Wilcox检验证实，与单一代谢通路内的酶相比，调控通路分支点的酶更易受到生境特异性选择（p=0.0047）。特别值得注意的是，脂肪酸β-氧化途径（KEGG M00087）的酶在环境分离株中高度保守，却在CF分离株中呈现正向选择，暗示CF肺部富含脂肪酸的环境驱动了该途径的适应性演化。

单密码子分辨率揭示蛋白结构域差异选择

以群体感应主调控因子LasR和VI型分泌系统蛋白VgrG3为例，研究展示了单密码子分辨率分析的价值。虽然LasR在环境分离株中整体保守（dN/dS=0），但在CF分离株中选择约束减弱（dN/dS=无穷大）；结构映射显示其N端OdDHL结合域在CF分离株中特异性变异。相反，VgrG3在CF分离株中保守（dN/dS=0.22），在环境分离株中易变（dN/dS=3.67），且变异热点集中于特定结构域，可能反映CF菌株中T6SS效应因子多样性的需求。

CF分离株中的基因丢失热点区

研究识别出PA2125-PA2384基因组区域为"应急区"（contingency region），其在CF分离株中的基因丢失频率显著高于其他基因组区域（p<<0.01）。该区域包含14个操纵子、260个ORF，涉及psl外多糖合成、生物膜调控和VI型分泌系统等功能。特别值得注意的是，超过70%的CF分离株丢失了PA2228-vqsM-qsrO操纵子。

藻酸盐合成对psl基因丢失的补偿效应

深入分析发现，psl生物合成基因簇的丢失与mucA基因的功能缺失突变显著相关。在psl基因簇完整的CF分离株中，mucA突变以同义替换为主；而在psl基因簇缺失的菌株中，mucA更易发生错义或无义突变，可能导致藻酸盐过量产生，补偿psl缺失造成的生物膜缺陷。这种巧妙的补偿机制揭示了病原菌在宿主压力下的进化权衡策略。

本研究通过创新性的dN/dS分析框架，揭示了铜绿假单胞菌在CF气道环境中基因组适应的精细图谱。不仅证实了核心基因组的保守性，更识别出206个生境特异性选择基因，其中许多是此前未被重视的潜在适应性因子。研究发现代谢分支点酶作为选择压力的主要靶点，从代谢控制理论层面解释了病原菌营养适应策略。此外，通过单密码子分辨率分析揭示了蛋白质功能域差异选择的新模式，以及基因丢失与补偿性突变间的进化关联。

这些发现对理解慢性感染中病原菌进化动力学具有重要启示：首先，dN/dS分析相比单纯突变频率统计更能反映适应性进化的本质；其次，代谢网络关键节点的可塑性可能是病原菌快速适应新环境的重要途径；最后，藻酸盐与psl多糖的替代关系为针对生物膜的治疗策略提供了新思路。该研究建立的分析方法与数据资源（已公开于Zenodo）将为后续病原菌进化研究提供重要工具，而揭示的适应性基因清单则为抗感染药物靶点发现提供了新方向。