辅助性肽脱甲酰酶在细菌适应性及耐药性中的流行与多重作用解析

《Molecular Biology and Evolution》：Unraveling the prevalence and multifaceted roles of accessory peptide deformylases in bacterial adaptation and resistance

本研究针对细菌中辅助性肽脱甲酰酶（PDF）的功能冗余现象，通过大规模基因组分析发现近半数细菌基因组携带多个PDF基因，且多位于可移动遗传元件。以霍乱弧菌为模型证实辅助性PDF（Def2VCH）通过关键位点突变降低与抑制剂actinonin（ACT）的亲和力，从而介导耐药性。整合子携带的PDF基因可在不同菌种间传播耐药性，揭示了环境抗生素压力驱动PDF基因多样化的进化机制，为PDF靶向抗生素的临床应用风险提供预警。

　　

在细菌的蛋白质合成过程中，肽脱甲酰酶（Peptide Deformylase， PDF）扮演着至关重要的角色。它负责催化新生蛋白质N端甲酰基的移除，这是蛋白质成熟的关键步骤。由于PDF在细菌中高度保守且为生存所必需，而真核生物细胞中不存在同源物，它长期以来被视为开发新型抗生素的理想靶点。然而，一个令人费解的现象是，尽管PDF功能保守，许多细菌却编码多个PDF基因。这种冗余现象的普遍性、分布规律及其生物学意义，在过去二十多年间始终未被充分揭示。随着抗生素耐药性问题日益严峻，理解细菌如何通过基因冗余等策略应对环境压力，对于评估现有靶点的成药性及开发新策略至关重要。

为了系统解答这些问题，由摩根·兰贝里乌（Morgan Lambériux）领衔的研究团队开展了迄今为止规模最大的PDF基因分布与功能研究。研究人员首先对5042个细菌参考基因组进行了生物信息学分析，惊人地发现高达48%的物种拥有不止一个PDF基因，其中甚至有的物种（如Dactylosporangium vinaceum）拥有多达7个PDF拷贝。进一步分析表明，这种多拷贝现象存在显著的种内变异，提示部分PDF基因可能位于质粒、整合子等可移动遗传元件（Mobile Genetic Elements， MGEs）上。的确，他们在质粒数据库（PLSDB）中找到了667个携带PDF基因的小于1Mb的质粒，并在整合子基因盒数据库中鉴定出24个PDF基因盒，这些基因盒主要存在于弧菌属（Vibrio）细菌中。这些发现表明，PDF基因的多样性可能部分源于水平基因转移，并可能赋予细菌适应性优势。

为了验证这一假说，研究团队选择携带两个PDF（Def1_VCH和Def2_VCH）的霍乱弧菌（Vibrio cholerae）作为模型进行功能研究。通过基因敲除和回补实验，他们证实两个PDF均具有酶活性，可单独支持细菌生长。然而，在对抗天然PDF抑制剂actinonin（ACT）时，两者表现出显著差异：缺失Def2_VCH会导致菌株对ACT的敏感性增加20倍，而缺失Def1_VCH则无影响。这表明辅助性PDF Def2_VCH主要负责ACT耐药性。

为了在分子层面揭示耐药机制，研究人员解析了Def1_VCH和Def2_VCH与ACT复合物的高分辨率晶体结构。结构比对发现，尽管ACT在两者催化口袋中的结合位置和构象相似，但Def2_VCH中关键的精氨酸97（Arg97）被酪氨酸（Tyr97）取代，这一突变破坏了与ACT分子间的重要氢键。此外，疏水口袋中的异亮氨酸86和亮氨酸125在Def2_VCH中分别被甘氨酸和苯丙氨酸取代。点突变实验证实，将Def1_VCH的Arg97突变为Tyr即可使其获得类似Def2_VCH的高水平ACT抗性，反之亦然，明确了该位点是决定亲和力差异的关键。

研究还评估了整合子来源的PDF基因盒的功能。来自假黄杆菌（Pseudoxanthomonas suwonensis）的PDF基因盒（PsDef）在霍乱弧菌和大肠杆菌中均能赋予对ACT和另一种PDF抑制剂LBM415的强耐药性，且该基因盒表现出较高的重组活性，暗示其可能通过可移动整合子在不同菌种间传播，构成潜在的临床耐药风险。

本研究综合运用了多项关键技术方法。包括：1）大规模基因组生物信息学分析，基于RefSeq、PLSDB和整合子数据库，使用HMMER和Prokka进行基因注释和同源性搜索；2）分子微生物学技术，如Tn7转座子系统介导的染色体定点整合、条件性复制质粒介导的必需基因敲除、接合转移实验；3）生物化学与结构生物学方法，包括蛋白质纯化、晶体结构解析（分辨率为~1.8 ?）以及微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）；4）系统发育分析，使用IQ-TREE构建最大似然树。分析所涉细菌基因组数据均来自公共数据库（RefSeq, PLSDB）。

结果

近半数细菌物种携带多个PDF

对5042个细菌参考基因组的分析显示，48%的物种编码一个以上的PDF基因，超过2.7%的物种拥有三个以上PDF，表明PDF基因冗余在细菌界普遍存在。仅有31个基因组未检测到PDF基因，其中29个为缺乏多种必需基因的胞内共生菌。

催化基序的保守性与更新

对仅编码单个PDF的基因组进行分析后，对先前描述的三个保守催化基序（Motif I, II, III）进行了修订，提出了更精确的版本（Motif I: GDAAXQ； Motif II: EGCLS； Motif III: HEXXHXG）。80%的PDF含有这些更新后的基序，但仍有7.1%的基因组不含完全匹配的PDF，提示这些基序的严格保守对于所有细菌的PDF酶活可能并非绝对必需。

PDF编码于可移动遗传元件

在质粒数据库中，鉴定出667个携带PDF基因的小于1Mb的质粒，其中74%被预测为可移动质粒。在整合子基因盒集合中，发现24个PDF基因盒，主要存在于弧菌属细菌中。系统发育分析表明，弧菌整合子PDF与染色体上的辅助性Def2 PDF具有共同起源，而假黄杆菌的PDF基因盒则来源不同。

振动球菌科PDF的多样性

对136个振动球菌科完整基因组的分析表明，46.7%的物种编码多个PDF。系统发育分析将PDF分为Def1（保守的经典PDF，与FMT共操作子）和Def2（附属PDF，序列变异大，包括整合子PDF和某些弧菌NRPS/PKS基因簇中的PDF）两大主要进化枝。系统发育不协调性表明Def2 PDF主要通过水平基因转移传播。

霍乱弧菌携带两个活性PDF

霍乱弧菌的两个PDF（Def1_VCH和Def2_VCH）均具有酶活性，可单独支持细菌生长。Def2_VCH在核糖体结合关键位点（如Arg153）存在差异，可能影响其与核糖体的相互作用方式。

Def2降低对ACT的敏感性

功能实验表明，附属PDF Def2_VCH是霍乱弧菌对ACT产生耐药性的主要原因。其分子机制在于关键氨基酸 substitutions（如Arg97Tyr）降低了Def2_VCH与ACT的亲和力。点突变实验证实Tyr97是导致高水平耐药的关键残基。

整合子PDF具有酶活性且可介导耐药性

来自弧菌和假黄杆菌的整合子PDF基因盒在霍乱弧菌中均表现出酶活性。特别是假黄杆菌来源的PsDef，能赋予霍乱弧菌和大肠杆菌对ACT和LBM415的强耐药性，且其基因盒具有高重组活性，存在水平传播风险。

结论与讨论

本研究首次通过大规模基因组学揭示了细菌中辅助性PDF的广泛存在及其与可移动遗传元件的关联，打破了PDF作为单一持家酶的传统认知。研究证实，这些附属PDF并非冗余，而是在细菌适应环境压力中扮演关键角色，特别是通过进化出与经典PDF不同的抑制剂结合特性来介导对天然抗生素（如ACT）的耐药性。霍乱弧菌Def2_VCH及其在整合子中发现的同源物（如PsDef）的功能，强烈提示在自然环境中存在由细菌产生的PDF抑制剂，从而驱动了这类耐药基因的筛选与传播。

这项研究的意义深远。首先，它揭示了细菌基因组中隐藏着一个丰富的PDF耐药基因库，这些基因可通过质粒和整合子等可移动元件传播，对基于PDF抑制剂的新型抗生素的临床开发和应用构成了潜在威胁。其次，研究结果表明，PDF功能的多样性可能超出当前认知，某些非典型PDF（如III型PDF）可能在特定环境压力（如氧化应激）下被激活，这为理解细菌的应激适应机制提供了新视角。最后，该研究强调了在评估抗菌药物靶点时，必须充分考虑靶点基因在病原体中的冗余性、可移动性及其在自然环境中的进化历史。这些发现不仅增进了对细菌基本生理过程和适应性进化的理解，也为应对抗生素耐药性挑战提供了重要的科学依据。论文发表于《Molecular Biology and Evolution》。