相干X射线揭示拥挤蛋白溶液中分子扩散异常与笼效应机制

《Nature Communications》：Coherent X-rays reveal anomalous molecular diffusion and cage effects in crowded protein solutions

本研究利用欧洲X射线自由电子激光器（EuXFEL）的兆赫兹X射线光子关联光谱技术（MHz-XPCS），首次在微秒时间尺度直接观测到高浓度铁蛋白溶液中存在的异常扩散现象。通过δγ理论模型分析，发现蛋白质长时扩散同时受流体动力学相互作用和直接相互作用调控，并证实笼效应是导致扩散异常的关键机制。该研究为理解细胞内蛋白质输运过程提供了分子层面的动态视角，对优化铁蛋白药物递送系统具有重要指导意义。

　　

在活体细胞的细胞质中，蛋白质如同置身于一个摩肩接踵的分子集市，每时每刻都在进行着复杂的运动。这种运动不仅关系到营养物质和信号分子的传递，更直接影响着细胞代谢速率和生命活动的效率。然而，由于细胞内环境的极端拥挤性——蛋白质浓度可达300-400 mg/mL，使得蛋白质分子运动远比在稀溶液中复杂。传统观点认为，这种拥挤环境会显著降低蛋白质的扩散速率，但其背后的物理机制一直存在争议：究竟是流体动力学相互作用（即蛋白质运动时带动周围溶剂流动产生的效应）占主导，还是蛋白质之间的直接相互作用（如静电作用和范德华力）更为关键？更令人困惑的是，在如此拥挤的环境中，蛋白质扩散往往表现出“异常扩散”特征，偏离经典的布朗运动规律。

以往的研究技术，如动态光散射（DLS）和核磁共振（NMR），要么只能探测远大于蛋白质尺寸的长度尺度，要么时间分辨率不足，难以捕捉微秒时间尺度的分子运动。而微秒尺度恰好是蛋白质从“短时扩散”（在邻近分子形成的笼内运动）过渡到“长时扩散”（突破笼限制的真实位移）的关键时间窗口。这一研究空白限制了人们对细胞内蛋白质输运机制的深入理解。

针对这一挑战，由瑞典斯德哥尔摩大学Anita Girelli领衔的国际研究团队在《Nature Communications》上发表了最新成果。他们利用欧洲X射线自由电子激光器（EuXFEL）独有的兆赫兹X射线光子关联光谱技术（MHz-XPCS），以铁蛋白（ferritin）为模型系统，首次在分子长度尺度和微秒时间分辨率下，直接观测了高浓度蛋白质溶液（最高达730 mg/mL）中的扩散动力学。

铁蛋白是一种理想的模型系统：其24个亚基形成的中空笼状结构内部富含铁离子，能产生强烈的X射线散射信号；同时，铁蛋白在药物递送、疫苗开发和纳米材料等领域具有广泛应用前景，理解其扩散行为对优化这些应用至关重要。研究人员通过精心设计的实验方案，包括样品制备、X射线参数优化和辐射效应控制，成功获取了高质量的动态散射数据。

关键技术方法包括：利用EuXFEL的MHz-XPCS技术在微秒时间尺度测量强度自相关函数g₂(q,t)；通过小角X射线散射（SAXS）获取结构因子S(q)；结合动态光散射（DLS）测定稀溶液中的扩散系数D₀；采用δγ理论模型分析流体动力学函数H(q)；通过双指数拟合分离短时和长时扩散组分。

散射强度I(q)和结构因子S(q)

通过分析不同浓度铁蛋白溶液的SAXS数据，研究人员发现随着浓度增加，I(q)出现明显的关联峰，表明蛋白质之间形成了有序排列。从稀释溶液（9 mg/mL）的散射数据拟合得到铁蛋白核心半径约为4.0 nm，与已知结构一致。S(q)的峰值位置q₀随浓度增加向高q值移动，说明蛋白质间的平均距离随拥挤度增加而减小。EuXFEL与ESRF（欧洲同步辐射装置）测得的S(q)高度一致，验证了数据的可靠性。

强度自相关函数g₂(q,t)和q依赖的扩散系数D(q)

g₂(q,t)的分析揭示了浓度依赖的动态行为：在低浓度（70 mg/mL）下，g₂(q,t)呈单指数衰减，表现为简单的布朗运动；而在高浓度（730 mg/mL）下，衰减曲线明显偏离单指数行为，需用拉伸指数函数拟合，Kohlrausch-Williams-Watts（KWW）指数α小于1，表明蛋白质运动呈现异质性。计算得到的扩散系数D(q)随q值变化，在q = q₀处出现最小值，这种“德热纳窄化”现象表明蛋白质在接近其平均间距的长度尺度上运动受到阻碍。

流体动力学函数H(q)和自扩散系数D_s

通过H(q) = D(q)S(q)/D₀定义的流体动力学函数，研究人员量化了流体动力学相互作用的贡献。实验测得的H(q)与基于δγ理论的模型预测吻合良好，但需引入缩放因子。特别值得注意的是，H(q)的截距值D_s/D₀（自扩散系数与稀溶液扩散系数之比）随体积分数增加而急剧下降的速度远快于纯短时扩散的理论预测。这表明实验观测到的自扩散系数实际上包含了短时和长时扩散的共同贡献，且随着浓度增加，长时扩散的贡献愈发显著。

笼效应和长时扩散

对中间散射函数f(q,t)的深入分析为理解异常扩散的起源提供了关键证据。在最高浓度（730 mg/mL）下，f(q,t)明显表现出双指数衰减特征，通过双指数拟合可分离出快慢两个衰减组分，分别对应短时扩散系数D^short(q)和长时扩散系数D^long(q)。两者具有相似的q依赖性，但D^long(q)仅为D^short(q)的12%，表明长时扩散显著减慢。根据D^short(q)估算的相互作用时间τ_i约为4.25 μs，正好对应于两个指数函数的交叉时间，证实了双指数衰减源于短时和长时扩散的共存。

更有趣的是，慢组分的相对振幅A(q)符合A(q) = A₀exp(-q2δ2/6)的关系，其中A₀ = 89 ± 3%表明绝大多数蛋白质分子都参与了笼的形成，而δ = 1.0 ± 0.3 nm的平均位移说明蛋白质在笼内的“晃动”范围仅为其半径的一小部分。这种强烈的空间限制正是导致扩散异常的主要原因。

研究结论表明，MHz-XPCS技术成功揭示了拥挤蛋白质溶液中异常扩散的微观机制：在高浓度下，蛋白质分子被邻近分子形成的“笼”暂时囚禁，只能在有限范围内运动（短时扩散）；只有当笼结构发生重排时，蛋白质才能实现长距离位移（长时扩散）。这两种扩散模式的共存和转变导致了实验观测到的非指数弛豫行为。δγ理论模型在考虑缩放因子后能很好地描述流体动力学相互作用，但长时扩散的显著减慢主要归因于直接相互作用的影响。

这项研究的创新性在于首次在分子尺度和微秒时间分辨率下直接观测到了蛋白质扩散中笼效应的存在，并定量分离了短时和长时扩散的贡献。这不仅深化了对细胞内蛋白质输运物理机制的理解，也为优化基于铁蛋白的药物递送系统提供了重要参数——在药物缓释制剂中，扩散速率往往是决定生物利用度的关键因素。此外，该方法学框架可推广至更接近真实生物环境的复杂体系，如包含多种大小不同拥挤物的多组分系统，为最终揭示细胞内生命活动的物理基础开辟了新途径。