《International Immunopharmacology》：Dysregulated neutrophils contribute to bone loss in renal osteodystrophy by enhancing osteoclastogenesis: Insights from integrated bioinformatics and experimental validation
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中性粒细胞功能障碍通过PI3K-Akt通路介导肾性骨病骨代谢失衡，影响破骨细胞分化与骨重建平衡，为生物标志物和靶向药物开发提供依据。
卢婷薇|董志瑞|姜凌勇|戴圆
上海交通大学医学院口腔颌面外科口腔与颅颌面外科系颅面正畸中心；国家口腔医学中心；国家口腔疾病临床研究中心；上海口腔医学重点实验室；上海口腔研究所，中国上海210000
摘要 肾性骨营养不良（ROD）是慢性肾病的一种主要骨骼并发症，其特征是骨重塑失调。中性粒细胞对维持骨稳态至关重要。然而，它们在ROD的骨免疫微环境中的功能尚不清楚。为了研究ROD中中性粒细胞与骨代谢失衡之间的相互作用，我们首先对ROD患者进行了转录组分析，发现骨稳态明显紊乱。这些发现通过ROD的小鼠模型得到了验证，该模型表现出骨质疏松的表型以及破骨细胞活性增加。通过整合生物信息学和实验验证，我们确定了中性粒细胞在ROD骨微环境中的功能缺陷，包括脱颗粒作用减弱、中性粒细胞胞外陷阱形成减少以及数量下降。在共培养系统中，ROD来源的中性粒细胞通过调节细胞因子释放间接增强了骨髓来源的巨噬细胞的破骨细胞生成，这一过程由PI3K-Akt信号通路介导。此外，我们通过计算机模拟和体外实验初步鉴定出潜在的生物标志物和治疗化合物，突显了ROD管理的转化前景。我们的研究结果表明，中性粒细胞功能障碍破坏了破骨细胞生成与成骨细胞生成的平衡，从而导致ROD骨微环境中的病理性骨丢失。
引言 肾性骨营养不良（ROD）是慢性肾病（CKD）的一种骨骼并发症，其特征是骨细胞活性异常和代谢稳态紊乱，导致骨微结构恶化及生物力学完整性受损[1]。临床上，ROD表现为高周转率的纤维性骨炎或低周转率的静止性骨病。纤维性骨炎的特点是破骨细胞和成骨细胞活性升高，而静止性骨病则表现为骨重塑减少[2]。ROD中的骨丢失是多因素引起的，在分子水平上尚未完全明了[3]。患者常伴有持续的低度炎症，表现为循环中C反应蛋白和IL-6水平升高[4]。ROD中的交感神经过度活跃可能进一步刺激肾脏和全身免疫细胞，促进促炎细胞因子的释放，从而加重肾脏和骨骼损伤[5]。先天免疫细胞（包括中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）通过分泌细胞因子、趋化因子和蛋白酶参与ROD的进展[6]。然而，ROD中骨代谢与免疫反应之间的相互作用尚未得到充分研究，需要更深入的机制探究。
中性粒细胞占循环白细胞的50%至70%，是人类体内最丰富的免疫细胞。大约60%的骨髓髓系前体细胞分化为中性粒细胞[7]。作为对感染和损伤的第一响应者，中性粒细胞粘附于内皮细胞，沿趋化梯度迁移，并发挥吞噬作用、脱颗粒作用以及形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）等效应机制[8]。在脱颗粒过程中，中性粒细胞释放髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白酶，这些物质有助于染色质解聚并最终形成NETs[9]。除了在免疫中的传统作用外，新证据表明中性粒细胞还积极参与骨代谢的调节。例如，骨髓炎骨中的IL-8水平升高可促进中性粒细胞的募集和破骨细胞的生成，而中性粒细胞来源的IL-10可增强成骨细胞活性并抑制骨吸收[10,11]。中性粒细胞还可能通过CXCL12/CXCR3信号轴促进骨髓间充质干细胞的募集，从而促进骨形成[12]。尽管有这些发现，但ROD骨微环境中中性粒细胞的表型和功能特征及其潜在机制仍不甚明了。阐明这些方面对于理解CKD引起的ROD的病理生理机制和寻找新的治疗靶点至关重要。
鉴于中性粒细胞在骨免疫微环境中的核心作用，本研究旨在明确它们对ROD发病机制的具体贡献。我们对ROD患者的转录组数据进行了生物信息学分析，以表征其骨代谢特征。我们建立了ROD的小鼠模型，并通过组织病理学评估证实了破骨细胞的异常激活。结合生物信息学和组织学方法，研究了中性粒细胞的变化及其对ROD骨免疫微环境中破骨细胞功能的调节作用。此外，我们还构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、转录因子（TF）-基因和基因-微小RNA（miRNA）相互作用网络，以识别关键介导因子和潜在机制。通过在线药物平台和计算机模拟及体外实验初步验证了潜在的治疗化合物。这种综合方法旨在揭示中性粒细胞导致ROD骨丢失的机制，并为开发针对性的临床干预措施提供新的见解。
伦理声明 本研究中的所有动物实验均遵循美国国家研究委员会关于实验动物护理和使用的指南以及ARRIVE（动物研究：报告体内实验）指南进行，并获得了上海交通大学的批准（批准编号：SH9H-2023-A92–1）。
ROD患者中骨稳态的紊乱 慢性肾病（CKD）常伴有骨代谢紊乱，容易导致骨质疏松，表现为骨微结构的进行性恶化。值得注意的是，CKD-MBD常常发展为ROD，其中包含多种组织学骨病变[32]。为了研究CKD进展过程中骨微环境的变化，我们分析了GEO数据库中的GSE194056数据集。该数据集包含了9名健康对照组和20名讨论 慢性肾病（CKD）患者的骨折风险比普通人群高4-5倍。这种增加的易感性主要是由于骨重塑失调、矿化减少和骨体积减小，从而导致骨力学强度下降[41,42]。尽管最近对CKD发病机制的理解有所进展，改善了其并发症的预防和管理，但CKD引起的ROD的具体病理生理机制仍不清楚结论 总之，本研究采用综合生物信息学和实验方法阐明了中性粒细胞在CKD引起的ROD中的作用机制。我们发现中性粒细胞功能障碍破坏了ROD骨微环境中的破骨细胞-成骨细胞平衡。此外，我们提供了初步证据，表明中性粒细胞来源的细胞因子在PI3K-Akt信号通路激活后参与了破骨细胞分化的失调。通过基于网络的分析，
CRediT作者贡献声明 卢婷薇： 撰写 – 原始草稿、可视化、方法学、形式分析、概念构思、实验设计。董志瑞： 可视化、方法学、形式分析、实验设计。姜凌勇： 监督、资金获取、概念构思。戴圆： 撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念构思。
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。致谢 本研究得到了国家自然科学基金 （戴圆资助项目编号82401621，姜凌勇资助项目编号82430032）的支持。本研究中的示意图使用BioRender.com
