新型同种异体CAR-T细胞平台：基于微同源介导末端连接修复的低脱靶潜力技术

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Novel allogeneic CAR T-cell platform involving microhomology-mediated end joining repair and low off-targeting potential

本研究针对CRISPR-Cas基因编辑在异体CAR-T疗法中存在的随机修复机制导致的脱靶风险，开发了一种靶向T细胞受体β恒定区（TRBC）的新型crRNA。结合高保真酶AsCas12a Ultra，该策略通过微同源介导末端连接（MMEJ）修复通路实现精准编辑，显著降低脱靶效应。研究首次发现并验证了一类保留CD3表达但TCR功能缺失的T细胞亚群（CRAFT细胞），其在体外和体内均无移植物抗宿主病（GVHD）风险，且扩增能力与未编辑T细胞相当。进一步构建的CD19或BAFF-R靶向CRAFT CAR-T细胞展现出强效抗原特异性杀伤功能，并能作为双特异性T细胞衔接器（BiTE）的效应细胞，增强肿瘤清除能力。该平台为安全、高效的“现货型”CAR-T疗法提供了新思路。

　　

在癌症免疫治疗领域，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已展现出革命性潜力，尤其是自体CAR-T在血液肿瘤治疗中取得显著成效。然而，自体疗法存在制备周期长、患者T细胞质量参差不齐等局限，促使科研人员转向开发“现货型”同种异体CAR-T疗法。但这一策略面临严峻挑战：供体T细胞表面的T细胞受体（TCR）可能识别宿主组织的主要组织相容性复合体（MHC），引发致命的移植物抗宿主病（GVHD）。传统CRISPR-Cas9技术通过敲除TCRα（TRAC）或TCRβ（TRBC）基因规避GVHD风险，但其依赖的非同源末端连接（NHEJ）修复机制易导致随机插入/缺失（indel），造成高脱靶风险和基因毒性，且部分编辑后T细胞增殖持久性不足。

为解决上述问题，美国梅奥诊所研究团队在《Molecular Therapy Nucleic Acids》发表最新研究，提出一种基于CRISPR-Cas12a Ultra酶与新型crRNA的精准编辑平台。该crRNA靶向TRBC基因特定区域，引导DNA断裂通过微同源介导末端连接（MMEJ）通路修复，显著提升编辑可预测性并降低脱靶风险。

研究团队从健康供体外周血单核细胞（PBMCs）中分离T细胞，通过CD3/CD28磁珠激活后，使用慢病毒载体导入CD19或BAFF-R靶向的CAR基因。随后采用电转法将AsCas12a Ultra与crRNA形成的核糖核蛋白（RNP）复合体导入细胞，实现TRBC特异性敲除。通过流式细胞术分选获得TCR阴性且CD3阳性（CRAFT细胞）或双阴性（DN细胞）的CAR-T群体，并利用体外共培养模型、异种移植小鼠模型及蛋白质结构预测等技术评估其功能。

Unique crRNA mediates an efficient TCRβ-specific knockout to generate allogeneic T-cells with MMEJ repair and low off-targeting

研究显示，CRAFT crRNA联合AsCas12a Ultra在原发性人T细胞中实现95.4%的TRBC编辑效率，显著高于SpCas9/sgRNA组合（64.6%）。深度测序证实CRAFT策略优先激活MMEJ修复，使90.6%的等位基因发生精准缺失，而SpCas9组仅44.7%。脱靶预测表明，传统sgRNA可能误切WNT3A等抑癌基因外显子，而CRAFT crRNA无外显子脱靶风险。

CRAFT-cells evade alloreactivity in vitro

在混合淋巴细胞反应中，CRAFT细胞与异体树突状细胞（DCs）共培养后未进入增殖期（EdU掺入率低），且经CD3/CD28再刺激后扩增能力与未编辑T细胞相当，证实其无体外同种异体反应性。

CRAFT-cells do not cause GVHD in immunodeficient mice

将CRAFT细胞注射至免疫缺陷NSG小鼠后，动物无GVHD相关体重下降或死亡，且42天后外周血中未见人T细胞残留，器官免疫组化检测未发现CD3⁺或CD8α⁺T细胞浸润。

Validating CRAFT-cells as a viable platform for allogeneic CAR T-cell production

CRAFT CAR-T细胞在体外扩增14天后，折叠扩增倍数显著高于DN CAR-T细胞，且记忆T细胞亚群比例与 exhaustion 标志物表达无异常，表明编辑过程未影响T细胞功能状态。

CRAFT CAR T-cells show potent, in vitro antigen-specific cytotoxicity

CD19 CRAFT CAR-T细胞在靶向Nalm-6（急性淋巴细胞白血病细胞系）和Z-138（套细胞淋巴瘤细胞系）时，CD107a脱颗粒率和颗粒酶B释放量与未编辑CAR-T细胞相当，且杀伤活性依赖抗原特异性。

CRAFT CAR T-cells elicited in vivo anti-tumor effects without causing GVHD

在Nalm-6淋巴瘤小鼠模型中，BAFF-R CRAFT CAR-T治疗组动物肿瘤消退且无GVHD症状，生存率与DN CAR-T组相近，而未编辑CAR-T组因GVHD导致死亡率升高。

CRAFT CAR T-cells can act as the effector cells for bispecific T-cell engager

CRAFT CAR-T细胞表面完整的CD3分子可被CD19/CD3 BiTE（blinatumomab）招募，介导对BAFF-R阴性肿瘤细胞的杀伤，而DN CAR-T细胞因CD3缺失无此功能。

研究结论指出，CRAFT平台通过MMEJ导向的TRBC编辑，首次实现了TCR信号与CD3功能的解耦，产生兼具低GVHD风险和BiTE协同潜力的新型异体CAR-T细胞。AlphaFold2结构预测显示，CRAFT细胞中截短的TCRβ链仍能维持CD3复合体空间构象，而DN编辑则破坏关键α螺旋结构。该技术为多基因编辑“装甲化”CAR-T疗法奠定基础，尤其适用于联合BiTE治疗微小残留病变或惰性淋巴瘤。未来需进一步探索CRAFT细胞在人体内的持久性及与宿主免疫系统的互作机制。