免疫抑制策略减轻AAV基因疗法背根神经节毒性机制与临床转化研究

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Inhibition of immune response reduces pathology in dorsal root ganglia and peripheral nerves in cynomolgus macaques following AAV gene therapy

本研究针对腺相关病毒(AAV)基因疗法经脑脊液给药后引发的背根神经节(DRG)毒性难题，通过时间序列分析发现免疫反应是介导神经元退化的关键机制。研究人员采用地塞米松联合他克莫司的免疫抑制方案，在食蟹猴模型中成功将三种不同AAV载体（AAVhu68-hSMN1、AAV9-hGBA1和AAV9-mir-SOD1）诱导的DRG病理严重程度降低67%-100%，首次证实免疫调节可跨载体普适性缓解AAV毒性，为临床安全应用提供新策略。

　　

当腺相关病毒(AAV)成为体内基因治疗的主要递送工具时，科学家们在非人灵长类动物中发现了一个令人担忧的现象：通过血液或脑脊液给药的AAV基因疗法，竟会引发背根神经节(DRG)神经元和周围神经纤维的退化。这种毒性反应不仅出现在多项临床前研究中， autopsy研究也提示人类患者可能出现类似病理改变。更棘手的是，这种毒性似乎与AAV载体本身相关，而非特定转基因或衣壳类型，意味着它可能是AAV基因治疗的“类效应”难题。

为揭开这一毒性反应的神秘面纱，来自Biogen的研究团队在《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》发表了突破性研究。他们发现，AAV介导的DRG毒性并非直接由病毒颗粒引起，而是机体免疫系统对AAV载体的过度反应所致。这一发现犹如找到了解开谜题的关键钥匙，为解决AAV基因治疗安全性瓶颈提供了全新思路。

关键技术方法

研究采用食蟹猴模型，通过颅内池(ICM)或鞘内(IT)注射三种AAV载体（携带hSMN1、hGBA1转基因或SOD1靶向microRNA）。运用时间序列设计（给药后5、9、15、29天采样），结合RNA测序(RNA-seq)、加权基因共表达网络分析(WGCNA)、多重免疫检测、组织病理学和电子显微镜技术，系统评估免疫抑制方案（地塞米松+他克莫司±霉酚酸酯）对病理改善的效果。

AAVhu68-hSMN1在DRG中介导的毒性可在第15天检测到

研究人员首先建立了AAVhu68-hSMN1（携带人生存运动神经元1基因）的毒性时间进程模型。食蟹猴接受3.68×10¹³基因组拷贝(GC)的病毒后，从第15天开始出现DRG神经元退化/坏死和脊髓神经纤维退化。值得注意的是，电子显微镜在更早的时间点（第5天）就观察到内质网扩张和线粒体肿胀等超微结构改变，提示细胞损伤早于明显的组织学变化。

DRG中AAVhu68转基因RNA表达在第15天达到峰值，且表达与神经元死亡相关

转基因表达分析显示，DRG中hSMN1表达在第15天达到峰值，且表达水平与神经元损伤程度正相关。特别有趣的是，表达最高转基因的神经元往往被单核细胞浸润包围，暗示免疫细胞可能靶向攻击高表达外源基因的神经元。

AAVhu68转导增加DRG中先天免疫反应和核糖体/RNA加工及补体活性相关转录模块的表达，降低突触和线粒体功能相关转录模块的表达

通过转录组学分析，团队发现AAV处理后的DRG出现双相转录反应。早期（第5天）即出现先天免疫相关基因模块上调和突触/线粒体基因模块下调，这一变化甚至早于转基因表达峰值。值得注意的是，脊髓组织对这些变化的反应较弱，这可能解释了为什么DRG神经元比运动神经元对AAV毒性更敏感。

AAVhu68-hSMN1对DRG的局部先天免疫反应与神经元损伤相关

脑脊液(CSF)细胞因子分析提供了关键证据：CXCL10和MIP1-α在第5天就显著升高，远早于神经元退化被发现的时间点。更重要的是，CSF中CXCL10和MIP1-α水平与血清神经丝重链(NF-H)浓度正相关，而NF-H是神经元损伤的标志物。

第5天和第9天观察到免疫细胞浸润，先于DRG中的神经元退化/坏死

免疫组化分析揭示了免疫细胞浸润的时间动态：自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、B细胞和CD4⁺ T细胞在第5天就已进入DRG组织，而浆细胞样树突状细胞(pDCs)和CD8⁺ T细胞则在较晚时间点（第15和29天）出现。这种时序关系强烈提示免疫细胞不是简单地响应神经元死亡，而是主动参与毒性过程。

地塞米松、MMF和他克莫司在第29天降低ICM给药后AAVhu68-hSMN1介导的DRG毒性

基于上述发现，团队测试了免疫抑制方案的效果。令人振奋的是，地塞米松（糖皮质激素）、霉酚酸酯(MMF)和他克莫司（钙调神经磷酸酶抑制剂）联合治疗，显著降低了AAVhu68-hSMN1引起的DRG神经元退化和单核细胞浸润，且不影响转基因表达。

地塞米松、MMF和他克莫司在第43天降低ICM给药后AAV9-hGBA1介导的DRG毒性

为排除免疫反应仅针对特定转基因的可能性，团队在AAV9-hGBA1（携带人葡萄糖脑苷脂酶1基因）模型中重复实验。免疫抑制方案同样有效，将DRG神经元退化的发生率从100%（3/3动物）降至仅1/29个DRG样本，证明疗效不依赖于特定转基因。

地塞米松和他克莫司在第43天降低IT给药后AAV9-mir-SOD1介导的DRG毒性

最终，团队使用携带非蛋白质载体（靶向SOD1的microRNA）的AAV9载体进行验证。即使没有外源蛋白表达，免疫抑制方案（地塞米松+他克莫司，不含MMF）仍能显著降低DRG病理和血清NF-H水平，证明毒性机制主要源于对AAV衣壳的免疫反应，而非转基因产物。

研究结论与意义

这项研究首次系统阐明了AAV介导DRG毒性的免疫学机制，并提供了可行的临床干预策略。时间进程分析表明，免疫激活早于神经元损伤，包括I型干扰素信号通路激活、炎性因子释放和免疫细胞招募。特别重要的是，地塞米松联合他克莫司的免疫抑制方案对三种不同AAV载体均显示保护效果，表明这一策略具有广谱适用性。

研究还提出了潜在的生物标志物：CSF中CXCL10和MIP1-α的早期升高可能预测AAV毒性发生，与血清NF-H联合使用可提高监测敏感性。这一发现对临床实践尤为重要，因为许多神经退行性疾病患者本身就有NF-H升高，单独使用NF-H难以区分疾病进展与治疗副作用。

该研究的临床转化价值显著：目前已有超过200种AAV基因疗法进入临床，安全性问题成为制约其广泛应用的关键瓶颈。本研究提供的免疫抑制方案可直接应用于临床试验，有望显著提高AAV基因治疗的安全性窗口。同时，研究提示需要对患者进行个体化免疫监测，因为个体间免疫反应的差异可能是毒性发生不一致的重要原因。

总之，这项工作不仅解决了AAV基因治疗领域的关键安全性问题，也为理解病毒载体与宿主免疫系统互作提供了新视角。随着更多患者接受AAV基因治疗，这种基于免疫机制的毒性防护策略可能成为标准护理的一部分，最终使更多患者从基因治疗创新中受益。