AAV5neo载体改造：通过直接注射改善脑组织分布的新型基因治疗策略

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Modified AAV5 capsid for improved brain biodistribution following direct injection in preclinical models

本研究针对中枢神经系统（CNS）基因治疗中AAV5载体因唾液酸（SIA）结合受限导致脑内分布不足的问题，开发了AAV5变体AAV5neo（M569V突变）。通过小鼠、小型猪及非人灵长类模型实验，证实AAV5neo在降低10倍剂量下仍能实现更广泛的脑区转导和更高效率的转基因表达，为局部CNS基因治疗提供了高效载体。

　　

中枢神经系统（CNS）疾病是全球致残和死亡的主要原因之一，但95%的患者缺乏有效治疗手段。血脑屏障（BBB）的存在限制了传统药物和系统给基因治疗策略的效果，而直接脑内注射虽能精准靶向，却因病毒分布范围有限常需多次注射。腺相关病毒（AAV）因其非致病性、低免疫原性和长期表达特性成为CNS基因治疗的重要工具，其中AAV5血清型因其低血清流行率和独特的轴突运输能力备受关注。然而，AAV5依赖唾液酸（SIA）作为初始附着因子，而大脑中高浓度的SIA（如N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac）可能反而限制其与细胞表面受体AAVR的结合，从而影响转导效率。

为突破这一瓶颈，uniQure生物制药公司的研究团队通过理性设计对AAV5衣壳进行单点突变（M569V），开发出新型载体AAV5neo。该变体旨在减弱其与SIA的结合依赖性，同时保留AAVR介导的内化途径。研究人员通过体外细胞系（如HEK293T、COS-1）、脑类器官及小鼠、小型猪、非人灵长类（NHP）等多物种模型，系统评估了AAV5neo的转导效率、生物分布及治疗潜力。

关键技术方法

研究采用定点突变构建AAV5neo质粒，通过聚乙烯亚胺（PEI）转染HEK293T细胞生产病毒。体外实验包括荧光显微镜、流式细胞术及荧光素酶报告基因检测；体内研究采用C57BL/6J小鼠、Libechov小型猪和食蟹猴（Macaca fascicularis），通过立体定向注射进行脑内给药，利用免疫组化、qPCR、单核RNA测序（snRNA-seq）及3D光片显微镜分析生物分布和细胞类型转导。

AAV5neo在体外具有细胞类型依赖性的转导效率降低但保留功能

在COS-1、HEK293T等细胞系中，AAV5neo的nLuc活性比AAV5低18-28倍，但在神经元来源的SH-SY5Y细胞中差异缩小（5-6倍）。长期培养的脑类器官中，AAV5neo仍能持续表达eGFP，但阳性细胞数低于AAV5，表明其转导效率虽减弱，但功能完整。

AAV5neo的体外转导不依赖SIA但需AAVR参与

神经氨酸酶A处理去除细胞表面SIA后，AAV5转导效率下降70%，而AAV5neo不受影响。相反，抗AAVR抗体会使两种衣壳的转导效率均降低80%，且AAVR过表达可增强AAV5neo转导，证实其进入机制仍依赖AAVR。

N-乙酰神经氨酸抑制AAV5但不影响AAV5neo

高浓度Neu5Ac（25 mM）使AAV5转导效率下降90%，而AAV5neo在同等条件下转导活性反而提升，尤其在低感染复数（MOI）下差异更显著，提示大脑内高SIA环境可能抑制野生型AAV5的细胞附着。

AAV5neo衣壳提升小型猪脑内转基因递送效率

小型猪壳核注射后，AAV5neo的eGFP阳性面积较AAV5扩大3倍，载体基因组拷贝数在近注射点区域提升27-75倍。snRNA-seq显示eGFP主要表达于寡突胶质细胞（83%）和神经元（47.5%），证实其跨细胞类型转导能力。

非人灵长类模型中AAV5neo展示更强治疗效力

食蟹猴壳核注射靶向α-突触核蛋白（SNCA）的微RNA（miSNCA）后，低中剂量AAV5neo的载体DNA和miRNA表达水平与中高剂量AAV5相当，且SNCA mRNA和蛋白降低效果显著（60%-95%）。snRNA-seq显示神经元（54.9%）和星形胶质细胞（24.8%）为主要转导靶点。

3D生物分布图谱证实AAV5neo递送效率更高

光片显微镜成像显示，AAV5neo在小鼠脑内扩散更广，尤其在皮层区域eGFP阳性细胞密度显著高于AAV5（1,477 vs. 720 cells/mm3），证实其克服SIA限制后实现更均匀的脑内分布。

结论与意义

本研究通过理性工程设计证明，AAV5neo的M569V突变通过削弱其与SIA的结合，避免了大脑内高浓度SIA对病毒附着的竞争性抑制，从而更有效地利用AAVR介导的内化途径。在多物种模型中，AAV5neo均表现出更优的脑内分布、转导效率及治疗效力，且所需剂量降低10倍。这一策略不仅为帕金森病等CNS疾病提供了更具潜力的基因治疗载体，也为优化AAV衣壳与宿主互作提供了新思路。未来需进一步探讨AAV5neo对神经免疫调节的潜在影响，以完善其临床转化前景。