光学基因组作图技术揭示工程化iPSC系基因组重排：基因编辑精准性评估新策略

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Unveiling genomic rearrangements in engineered iPSC lines by optical genome mapping

本研究通过光学基因组作图（OGM）技术系统性评估了CRISPR-Cas9、转座子及慢病毒三种基因编辑工具在诱导多能干细胞（iPSC）中引发的基因组结构变异（SV）。研究发现CRISPR-Cas9介导的AAVS1安全港位点插入仅引起靶向插入，而转座子与慢病毒编辑导致大量非预期插入及复杂SV，凸显OGM在细胞治疗产品基因组完整性监控中的关键价值。

　　

随着基因编辑技术的飞速发展，诱导多能干细胞（iPSC）作为疾病建模和细胞治疗的核心工具，其基因组稳定性日益受到关注。尽管CRISPR-Cas9等技术能够实现精准基因修饰，但编辑过程中可能引发的脱靶效应、基因组重排等非预期变异，仍是临床转化面临的重要安全隐患。传统检测方法如核型分析分辨率有限，难以捕捉亚显微水平的基因组结构变异（SV），而测序技术对大规模SV的检测灵敏度不足。如何全面评估基因编辑后iPSC的基因组完整性，成为领域内的关键挑战。

为解决这一问题，Darren Finlay等研究者在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》发表论文，首次系统利用光学基因组作图（OGM）技术，对比分析了CRISPR-Cas9、piggyBac转座子和慢病毒三种基因编辑方式在iPSC中诱导的SV。OGM技术通过荧光标记超长DNA分子（平均250 kbp），可检测低至500 bp的SV，并在≥300×基因组覆盖度下实现5%变异等位基因频率（VAF）的定量分析，为基因组稳定性评估提供了高分辨率视角。

研究团队通过以下关键技术开展实验：

1. 1.
   使用脐带血（UCB）或外周血单核细胞（PBMC）来源的iPSC作为亲本细胞；
2. 2.
   分别采用CRISPR-Cas9介导的AAVS1安全港位点插入、piggyBac转座子及慢病毒载体进行基因编辑；
3. 3.
   通过Bionano Saphyr平台进行OGM分析，利用罕见变异分析（RVA）流程筛选罕见SV，并通过双样本分析比对编辑细胞与亲本细胞的独特SV；
4. 4.
   结合传统核型分析验证OGM结果的可靠性。

研究结果

光学基因组作图流程的建立

OGM技术通过提取超高分子量DNA，经CTTAAG序列特异性荧光标记后，线性化扫描全基因组，生成可直观展示染色体畸变和SV的光学图谱（图1）。双样本分析功能可精准识别工程化细胞中特有的SV，排除亲本细胞固有变异干扰。

CRISPR-Cas9安全港位点插入的精准性验证

在AAVS1位点插入CAR（嵌合抗原受体）构建体的iPSC中，OGM仅检测到靶向插入事件（图2A-2D）。值得注意的是，CISH-KO AAVS1-CD123-IL15细胞系除靶向插入外，还发现Chr.11上234.5 kbp的EMSY基因重复（图2E），提示编辑或扩增过程中可能引入额外变异。传统核型分析显示所有亲本iPSC均为正常核型，但OGM揭示了多个亚显微水平的SV（图S1-S3），凸显其高分辨率优势。

转座子系统引发多位置插入与基因融合

piggyBac转座子编辑的iPSC中检测到大量异位插入（抗CLL1-IL15RF细胞46个，抗Meso细胞8个，sCAR细胞19个），且插入片段大小与载体构建体一致（图3A-3C）。其中抗CLL1-IL15RF细胞携带AHI1-SYNE1基因融合（图3D），该变异可能干扰神经发育相关蛋白功能，潜在风险需高度关注。

慢病毒编辑导致高频插入与缺失

慢病毒编辑的iPSC呈现更高SV负荷，抗CD123-CAR细胞中检测到105个插入（103个为~7 kbp载体序列），并伴随Chr.15和Chr.17的大片段缺失（图4A）；抗CLL1-CAR细胞中51个插入均位于基因区内，其中ADGRF3基因内插入达10 kbp，同时发现PLLP基因缺失（图4B-4C）。

OGM对小片段缺失的检测局限性

在HIF1A-KO和CISH-KO细胞中，OGM未能识别<500 bp的靶向缺失（图5A-5B），但可检测到伴随的EEF2K基因大片段缺失（图5C），表明OGM需结合测序技术以全面覆盖变异类型。

结论与讨论

本研究证实OGM能够高效捕捉基因编辑引发的基因组重排，特别是传统方法难以检测的平衡性重排、复杂插入事件。CRISPR-Cas9安全港编辑展现最优精准性，而病毒与非病毒整合工具均可能导致大量非预期插入，其中AHI1-SYNE1等基因融合事件提示潜在功能扰动风险。尽管OGM对小于500 bp的变异不敏感，但其高通量、低成本优势使其成为细胞治疗产品基因组安全评估的有力工具。研究者强调，结合DNA测序的OGM技术方案，可为iPSC临床转化提供标准化基因组完整性监控路径，推动细胞疗法安全性与规范化发展。