CRISPR/甲氨蝶呤整合策略降低TCR-T细胞染色体14缺失风险

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：CRISPR/methotrexate-integrated strategy for TCR-T cell engineering with reduced chromosome 14 loss

本研究针对传统慢病毒TCR-T疗法存在的插入突变风险和CRISPR介导的TRAC靶向导致的染色体不稳定性问题，开发了一种非病毒基因编辑平台。通过将CMV-pp65特异性TCR与甲氨蝶呤耐药性DHFR-FS选择标记整合至TRAC基因座，结合电穿孔参数优化和HDR增强剂应用，使TCR整合效率提升至约20%，再经6天MTX处理将工程化细胞纯度富集至70%。该策略显著降低了CRISPR相关的染色体14丢失（从10%降至<5%），且TRAC-TCR-T细胞表现出更强的IFN-γ/TNF-α分泌能力和更低耗竭标志物表达，为 safer adoptive TCR-T immunotherapy 提供了GMP兼容的解决方案。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，过继性T细胞疗法特别是T细胞受体工程化T（TCR-T）细胞疗法，为实体瘤和血液恶性肿瘤患者带来了新的希望。然而，传统的慢病毒转导方法存在插入突变风险，可能引发致癌性克隆扩增。近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术能够实现外源基因在T细胞受体α恒定区（TRAC）基因座的精准整合，但面临着敲入效率低和染色体14丢失的双重挑战。

针对这些技术瓶颈，上海交通大学医学院附属第一人民医院血液科的研究团队在《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》上发表了一项创新性研究。他们开发了一种CRISPR/甲氨蝶呤（MTX）整合策略，通过将非病毒基因编辑与代谢选择相结合，成功实现了高效、安全的TCR-T细胞工程化。

研究团队首先系统优化了电穿孔条件，发现T细胞激活后48小时进行电穿孔可获得最高效率（86.06%±5.84%）。通过比较不同缓冲液系统，他们确定B1 Mix/EO138组合的HDR效率（20.13%±0.12%）显著优于商业化的P3缓冲液系统。

进一步地，研究人员采用了组合优化策略，包括截短的Cas9靶序列（tCTS）修饰和HDR增强剂v2的应用，显著提高了TRAC基因座靶向的TCR敲入效率。tCTS修饰的供体模板在1-2μg浓度下能够显著增强HDR效率，而0.5μM HDR增强剂v2处理24小时则能进一步提升编辑效果。

在细胞功能方面，TRAC-TCR-T细胞在编辑后早期（0-2天）表现出短暂的增殖抑制，但到第4天完全恢复，其增殖动力学和存活率与未修饰T细胞和慢病毒TCR-T细胞相当。值得注意的是，TRAC-TCR-T细胞表现出更低的TCR表达变异系数，表明其表达更加均一。

功能分析显示，TRAC-TCR-T细胞与慢病毒生成的TCR-T细胞具有相当的细胞毒性能力和激活标志物上调水平。然而，细胞因子谱分析揭示了显著差异：慢病毒TCR-T细胞产生更高水平的颗粒酶B，而TRAC-TCR-T细胞则表现出更强的干扰素（IFN）-γ和肿瘤坏死因子α（TNF-α）分泌能力。转录组分析进一步证实，TRAC-TCR-T细胞中LAG3表达降低，IFN信号通路显著富集。

研究的核心创新在于引入了MTX富集策略。研究人员在TCR构建体旁连接了一个突变型人二氢叶酸还原酶（DHFR-FS）选择标记，从而创建了TRAC-DHFR-TCR-T细胞。剂量反应分析确定MTX的IC₅₀为27.94 nM，100 nM MTX处理6天可有效富集工程化细胞，将TCR阳性细胞纯度提升至约70%。

最关键的是，研究人员通过临床级荧光原位杂交（FISH）分析发现，CRISPR编辑会将染色体14丢失频率从基线<5%增加至约10%，而MTX富集后的TRAC-DHFR-TCR-T细胞中染色体14丢失频率恢复至接近未编辑T细胞的水平。这表明MTX选择不仅能富集成功编辑的细胞，还能选择性清除携带染色体异常的子代。

在治疗效能评估中，研究人员建立了免疫缺陷NCG小鼠的播散性异种移植模型。结果显示，MTX富集的TRAC-DHFR-TCR-T细胞在清除K562-A*02:01-pp65-荧光素酶靶细胞方面与慢病毒TCR-T细胞相当，均显著优于模拟T细胞对照组，并将中位生存期从26天延长至38天以上。

技术方法方面，研究使用了从健康捐赠者外周血单核细胞（PBMC）中分离的原代人CD3+ T细胞，通过CRISPR核糖核蛋白（RNP）电穿孔进行基因编辑，采用PCR生成的双链DNA作为同源定向修复模板，利用流式细胞术进行表型分析，并通过荧光原位杂交（FISH）评估染色体稳定性。

研究结果部分显示，电穿孔时机优化确定48小时为最佳时间点，缓冲液系统比较表明B1 Mix/EO138组合优于商业P3缓冲液。tCTS修饰和HDR增强剂v2的协同应用显著提高了敲入效率。功能比较研究发现TRAC-TCR-T细胞具有更均一的TCR表达和更强的细胞因子分泌能力。MTX富集策略不仅提高了工程化细胞纯度，还降低了染色体14丢失频率。体内实验证明TRAC-DHFR-TCR-T细胞具有强大的抗肿瘤活性。

讨论部分强调，该研究成功解决了CRISPR介导的TRAC靶向中的两大关键挑战——低敲入效率和染色体不稳定性。通过将HDR参数优化与MTX选择相结合，研究人员建立了一个同时提高编辑效率和保障基因组稳定性的平台。虽然MTX仅在体外制造阶段应用，并在输注前移除，但DHFR-FS变体的人类来源和低免疫原性报告支持了其临床转化潜力。

该研究的局限性在于未直接评估染色体易位等其他结构变异，且实验结果可能受特定实验系统（如Cas9核酸酶、dsDNA供体模板等）的影响。未来研究需要系统比较不同供体架构，并纳入专门的易位检测方法。

总之，这项研究开发了一种非病毒TCR-T细胞工程化平台，同时解决了病毒载体相关的插入突变风险和CRISPR介导编辑的基因组不稳定性问题。该策略实现了临床相关水平的TCR阳性细胞纯度，同时保持了与未编辑对照相当的染色体稳定性特征，为更安全、更精确的TCR-T细胞疗法开发提供了有前景的技术路线。