噻唑基-4-羧酸酮作为新型弹头，用于高效抑制SARS-CoV-2主要蛋白酶

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Thiazolyl 4-Carboxylate Ketone as a New Warhead for a Highly Potent SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitor

本研究设计并合成了含新型噻唑基4-羧酸酯酮弹头的肽模拟物SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）抑制剂，其中GK730抑制剂IC50达5.75 nM，其与Mpro的共价结合通过X射线结构解析证实，并显示高热稳定性。同时评估了GK730对宿主蛋白酶B和L的抑制活性及细胞毒性。

　　

Maria A. Theodoropoulou|Haifa El Kilani|Christiana Mantzourani|Dirk Jochmans|Johan Neyts|Kaixuan Zhang|Judith R?ske|Maroula G. Kokotou|Rolf Hilgenfeld|George Kokotos

雅典国立卡波迪斯特里安大学化学系，Panepistimiopolis，15771雅典，希腊

摘要

SARS-CoV-2主要蛋白酶（M^pro）是一种对病毒复制至关重要的酶，且不存在人类同源物，因此成为开发新型抗病毒药物的高度有吸引力的目标。尽管已经开发出几种M^pro抑制剂——其中一些已获得监管批准——但其使用有时会受到药物间相互作用的限制。在这项研究中，我们设计并合成了含有新型噻唑基4-羧酸酮类药效团的肽模拟SARS-CoV-2 M^pro抑制剂，该药效团此前曾被我们用于细胞质磷脂酶A₂抑制剂的开发。合成的化合物被评估了其对SARS-CoV-2 M^pro的体外抑制活性，最终鉴定出一种高效抑制剂（GK730），其IC₅₀值为5.75 nM。M^pro-GK730复合物的熔点显示出了高稳定性，这与其高抑制活性一致。通过X射线晶体结构分析，我们了解了GK729和GK730与M^pro的结合机制及作用原理。对宿主细胞蛋白酶cathepsin B和L的研究表明，GK730不抑制cathepsin B，但对cathepsin L的抑制作用较弱。此外，在Vero E6细胞中，GK730对野生型SARS-CoV-2菌株的EC₅₀值为5.70 μM，并且具有极低的细胞毒性（CC₅₀值大于100 μM）。

引言

2019年末，一种新的呼吸道传染病出现，即2019冠状病毒病（COVID-19），由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起[1] [2]。自COVID-19大流行以来，全球报告了超过7.76亿例确诊病例和700多万例死亡病例[3]。在病毒复制和存活过程中起关键作用的蛋白质中，SARS-CoV-2主要蛋白酶（M^pro）已成为抗冠状病毒药物研究的重点[4] [5] [6]。由于人类缺乏相应的蛋白酶，而M^pro的结构高度保守，使其成为有前景的治疗靶点。

2020年3月，我们中的一位研究人员（R.H.）报道了未结合状态的SARS-CoV-2 M^pro及其与α-酮酰胺抑制剂复合物的X射线结构（图1A）[7]。从那时起，文献中报道了大量SARS-CoV-2 M^pro抑制剂，这些抑制剂主要分为三类：共价肽模拟抑制剂、共价非肽类抑制剂和非共价抑制剂。共价抑制剂含有能够与蛋白酶催化位点Cys145共价结合的药效团，例如Michael受体[8] [9] [10] [11]。

辉瑞公司开发的一种SARS-CoV-2 M^pro肽模拟共价抑制剂nirmatrelvir（图1B）已获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，用于治疗COVID-19。nirmatrelvir需与CYP3A抑制剂利托那韦联合使用，以改善其药代动力学特性，商品名为Paxlovid[12] [13]。nirmatrelvir的类似物simnotrelvir（图1B）最近获得了中国国家药品监督管理局（NMPA）的批准，同样需要与利托那韦联合使用[14] [15] [16]。另一方面，ensitrelvir（图1B）是一种非共价抑制剂，最近获得了日本药品医疗器械局（PMDA）的全面批准[17] [18]。

与利托那韦联合使用的M^pro抑制剂可能会受到CYP3A抑制剂相关药物间相互作用的影响[19]。在这方面，leritrelvir（图1B）[20]和ibuzatrelvir（图1B）[21] [22]作为单药治疗COVID-19的替代方案显示出潜力。此外，SARS-CoV-2的持续进化可能导致耐药变异株的出现，这突显了开发新型COVID-19治疗手段的必要性[23] [24] [25] [26]。

虽然已批准的M^pro抑制剂和处于临床试验阶段的抑制剂通常含有硝基或α-酮酰胺类药效团，但实际上使用了多种类型的药效团，包括醛类、α-羟基甲基酮类、α,β-不饱和酯类、苯并噻唑酮类和磺胺类[11]。其中，苯并噻唑酮类药效团抑制剂（如化合物YH-53，图1C）最初是针对SARS-CoV M^pro开发的，后来也用于研究SARS-CoV-2 M^pro[27]。过去，我们开发了噻唑酮类化合物作为IVA组细胞质磷脂酶A₂（GIVA cPLA₂）的抑制剂，这种丝氨酸酶的抑制剂GK470在预防性胶原诱导关节炎模型中表现出与参考药物甲氨蝶呤相当的抗炎效果，并在治疗模型中的效果与参考药物恩利布利类似[28]。最近，我们报道了用于靶向癌症治疗的下一代GIVA cPLA₂噻唑酮类抑制剂[29]。因此，在本研究中，我们选择基于噻唑基4-羧酸酮类药效团设计并合成SARS-CoV-2 M^pro抑制剂。本文描述了这些抑制剂的合成过程、其对SARS-CoV-2 M^pro的体外抑制活性以及两种抑制剂与SARS-CoV-2 M^pro结合的X射线结构。同时，还评估了这些化合物在两种人类蛋白酶（cathepsin B和L）上的体外抑制活性，并介绍了最强抑制剂的抗病毒活性和人体血浆稳定性。

抑制剂设计

含有活化羰基的功能团是针对半胱氨酸蛋白酶的抑制剂中的高效药效团。然而，抑制剂的活性不仅取决于活化羰基的效能，还取决于其他能够形成适当氢键和/或疏水相互作用的基团的存在，这些基团有助于抑制剂整体结合到酶的结合口袋中。

结论

在这项研究中，我们报道了含有新型噻唑基4-羧酸酮类药效团的肽模拟SARS-CoV-2 M^pro抑制剂的设计和合成。在合成的化合物中，GK730（图18）表现出极高的共价抑制活性，IC₅₀值为5.75 nM。热位移测定表明M^pro-抑制剂复合物具有较高的稳定性。X射线晶体学证实了GK729和GK730与M^pro活性位点Cys145的共价结合。

一般信息

产品的纯化采用Merck?（德国达姆施塔特）Kieselgel 60 F₂₅₄ 230–400目色谱柱进行强制流动色谱分析，薄层色谱（TLC）则使用铝背硅胶板（0.2 mm，60 F₂₅₄）。色谱图的可视化通过紫外光或磷钼酸/ ninhydrin进行。熔点测定使用Buchi? 530仪器（瑞士Flawil）完成，结果未经校正。

CRediT作者贡献声明

Rolf Hilgenfeld：指导。 Maroula G. Kokotou：数据管理。 Judith R?ske：研究。 Kaixuan Zhang：研究。 Johan Neyts：研究。 Dirk Jochmans：研究，数据管理。 Christiana Mantzourani：研究。 Haifa El Kilani：撰写——初稿，研究，数据管理。 Maria A. Theodoropoulou：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，研究，数据管理。 George Kokotos：撰写——审稿与编辑，指导，概念构思。

资金来源

本研究得到了希腊研究与创新基金会（HFRI）第三批博士奖学金项目（奖学金编号：18603）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

致谢

我们将这项工作献给Rolf Hilgenfeld教授，他的深刻科学见解和开创性贡献一直激励着我们。