基于1,2,3-三唑结构的Grp94选择性抑制剂的设计、合成及其生物学特性

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Design, Synthesis, and Biological Properties Exhibited by 1,2,3-Triazole Based Grp94-selective Inhibitors

Grp94作为内质网驻留的Hsp90同源体，在折叠整合素和突变肌球蛋白中起关键作用。本研究通过氮扫和构效关系研究开发了新型Grp94选择性抑制剂47，其Grp94亲和力达76 nM，较前代产品提升15倍，对Hsp90α选择性达121倍。细胞实验证实该化合物可诱导MDA-MB-231细胞中整合素α2降解，并减少人小梁网细胞内突变肌球蛋白积累，为青光眼治疗提供了新策略。

　　

郝旭|达斯汀·J·E·赫瓦德|以利亚·邓恩|卢卡斯·A·查尔富恩|费利克斯·阿杜利|拉克尔·L·利伯曼|布莱恩·S·J·布拉格

化学与生物化学系，沃伦药物发现中心，圣母大学，305 McCourtney Hall，印第安纳州圣母市，46556，美国

摘要

Grp94 是 Hsp90 的内质网驻留同源物，负责多种底物蛋白的折叠和成熟，包括整合素和突变型肌球蛋白。研究表明，用小分子抑制 Grp94 可以减少乳腺癌细胞的迁移并促进突变型肌球蛋白聚集体的降解。本文描述了基于 BnIm 的氮扫描开发出的 1,2,3-三唑类 Grp94 选择性抑制剂。结构-活性关系研究确定了先导化合物 47，其对 Grp94 的亲和力为 76 nM，对 Hsp90α 的选择性为 121 倍。在细胞实验中，化合物 47 诱导了 MDA-MB-231 细胞中整合素 α2 的降解，并减少了人小梁网细胞内突变型肌球蛋白的积累。这些发现表明 47 是一种高效且选择性的 Grp94 抑制剂，具有治疗潜力。

引言

热休克蛋白（Hsps）是一类进化上保守的分子伴侣蛋白，通过调节底物蛋白的成熟来维持细胞稳态。¹ 在正常细胞生长过程中，Hsps 常处于表达状态；而在高温或恶性转化等细胞应激条件下，其表达会增强。² 90 kDa 热休克蛋白（Hsp90s）是真核生物中五大 Hsp 家族成员中最丰富的伴侣蛋白。Hsp90 与其多种共伴侣蛋白共同促进超过 400 种 Hsp90 依赖性底物蛋白的成熟、激活和稳定，其中许多底物蛋白与癌症的十个特征相关。³, ⁴, ⁵ Hsp90 以同二聚体形式存在，其 N 端结构含有一个独特的 Bergerat 折叠结构，这是一个可被药物结合的 ATP 结合位点，这使得开发选择性抑制剂成为可能。⁶

已有超过 20 种 Hsp90 N 端抑制剂（如 17-AAG、SNX-5422 和 AUY-922）进入临床试验用于癌症治疗。然而，由于心脏、眼部毒性及剂量限制等问题，大多数抑制剂未能成功。⁷, ⁸ 这些问题源于 hERG 蛋白的抑制、光感受器转运的紊乱以及热休克反应（HSR）的诱导。HSR 是由所有四种 Hsp90 同源物（Hsp90α、Hsp90β、葡萄糖调节蛋白 94（Grp94）和肿瘤坏死因子受体相关蛋白 1（TRAP1）的全面抑制引起的。此外，这四种同源物在 N 端 ATP 结合位点上的相似度超过 85%，因此难以选择性抑制它们。在真核生物中，两个基因分别编码可诱导表达和持续表达的 Hsp90α 和 Hsp90β，它们都位于细胞质中；而 Grp94 和 TRAP1 分别位于内质网（ER）和线粒体中。因此，开发针对特定 Hsp90 同源物的抑制剂可能有助于克服这些限制。

Grp94 是结构上最独特的 Hsp90 同源物，使其成为开发选择性 ATP 竞争性抑制剂的有希望的目标。与其他同源物相比，其结构差异源于初级序列中插入的 5 个氨基酸，这一结构变化在 Grp94 中形成了一个独特的二级结合口袋。⁹, ¹⁰ 已发现多种依赖 Grp94 的底物，包括 Toll 样受体、整合素和突变型肌球蛋白。总体而言，抑制 Grp94 既无毒，也没有抗增殖作用。此外，Grp94 仅在胚胎发育期间必不可少，对成熟细胞而言是非必需的。¹¹ 由于突变型肌球蛋白的积累是原发性开角型青光眼（POAG）的病因，因此 Grp94 成为治疗青光眼药物的开发目标。¹², ¹³

Grp94 是治疗由细胞内突变型肌球蛋白积累引起的开角型青光眼的有效靶点。¹⁴, ¹⁵ 肌球蛋白表达于眼部前部的小梁网（TM）组织中。myoc-OLF 基因的致病性突变会导致肌球蛋白错误折叠。由于内质网相关降解（ERAD）效率低下，突变型肌球蛋白会在 TM 细胞的内质网中积累。¹⁶ 研究发现 Grp94 是一种关键伴侣蛋白，它能通过与突变型肌球蛋白的共聚集来阻止其清除。¹⁷, ¹⁸ 通过敲低 Grp94 或化学抑制 Grp94，可促进突变型肌球蛋白通过自噬途径被清除。¹⁶ 抑制 Grp94 可降低细胞内突变型肌球蛋白的水平，但对野生型肌球蛋白无不良影响。¹⁶, ¹⁷ 因此，选择性 Grp94 抑制剂有望用于治疗与肌球蛋白相关的青光眼。

本文报道了新一代 Grp94 选择性抑制剂的发现。通过对 BnIm 的氮扫描，确定三唑环结构是优化的理想骨架（图 1）。随后的结构-活性关系（SAR）研究得到了先导化合物 47，其对 Grp94 的亲和力为 76 nM，对 Hsp90α 的选择性为 121 倍。与之前报道的第一代和第二代 BnIm 和 BnPh 相比，47 的亲和力分别提高了 15 倍和 8 倍。

章节摘录

通过氮扫描设计合成 Grp94 选择性抑制剂

此前已公开了两代 Grp94 选择性抑制剂：BnIm（1），其结构中苯酚基团和间苯二酚基团之间通过咪唑链连接；BnPh（2）则采用苯基链连接（图 1）。¹³, ¹⁹ BnIm（1）在荧光偏振（FP）实验中对 Grp94 的亲和力为 1.14 μM，对 Hsp90α 的选择性约为 13 倍；将咪唑结构替换为苯环后，亲和力和选择性均得到提升。

结论

对第一代 Grp94 选择性抑制剂 BnIm 进行了氮扫描，发现三唑环结构能显著提高结合亲和力。后续的结构-活性关系研究聚焦于芳香侧链，引入 2-丙基烃链后得到了化合物 47，其对 Grp94 的亲和力为 76 nM，对 Hsp90α 的选择性为 121 倍。分子对接分析显示 Asp162 离子在该化合物中起关键作用。

化学方法

所有试剂和溶剂均购自商业渠道，除非另有说明，否则按原样使用。反应在氩气保护下、火焰干燥或烘箱干燥的玻璃器皿中进行。薄层色谱（TLC）使用 Millipore Sigma 公司生产的 TLC Silica gel 60F254 板，通过钼染料或 254 nm 的紫外光进行可视化。快速柱层析使用粒径为 40–63 μm 的硅胶。^{1 1H} 和 ¹³C-NMR 光谱数据由 Bruker 公司采集。

CRediT 作者贡献声明

布莱恩·布拉格：撰写、审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金筹集、概念构思。拉克尔·L·利伯曼：撰写、审稿与编辑、资源协调、项目管理。费利克斯·阿杜利：数据管理。卢卡斯·A·查尔富恩：数据管理。以利亚·邓恩：数据分析。达斯汀·J·E·赫瓦德：数据验证、数据分析。郝旭：初稿撰写、实验设计、数据分析、数据管理

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（R01EY036107），资助对象为 RLL 和 BSJB。