生命如何构建其蛋白质工厂——一次一个RNA折叠的探索

《Biophysical Journal》：Understanding How Life Builds Its Protein Factories — One RNA Fold at a Time

为揭示核糖体快速组装机制，研究人员通过开发新型cryo-EM分析流程和RNA靶向技术（ASOs/dCas13），首次发现rRNA通过"RNA折叠子"（RNA foldons）模块驱动组装进程，绘制了细菌大亚基组装的高分辨率图谱，为RNA结构生物学和新型抗生素开发开辟了新路径。

　　

在生命的基本单元——细胞中，存在着一种精妙绝伦的分子机器，名为核糖体（ribosome）。它的职责至关重要，即根据遗传指令合成蛋白质，这些蛋白质是构建生命体并维持其一切功能活动的基石。核糖体本身结构极为复杂，由数十种核糖体蛋白质和一种特殊的核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）共同组装而成，其庞大与精密程度令人惊叹。然而，一个长期困扰科学家的核心谜团是：细胞如何在极短的时间内，从头开始、准确无误地构建成千上万个这样的复杂机器？以细菌为例，一个完整的核糖体其组装过程竟能在两分钟内完成。在这短暂的时间里，一条长长的rRNA链被转录出来，并迅速折叠成特定的三维结构，同时还要精确地招募超过50种不同的核糖体蛋白，并在一系列辅助因子的帮助下完成最终组装。这一过程的速度和准确性堪称分子世界的奇迹。

多年来，研究人员试图揭开这个谜题。传统的研究方法多聚焦于参与组装的蛋白质成分和辅助因子。科学家们通过基因敲除、抗生素处理或低温培养等手段，人为地“暂停”组装过程，从而捕捉组装中间体的“快照”。然而，这些方法存在局限性，尤其是难以捕捉到非常早期、存在时间极短的瞬态中间体，并且获得的样本结构异质性（heterogeneity）极高，给结构解析带来巨大挑战。更重要的是，在这些研究中，rRNA本身通常被视为一个相对被动的“脚手架”，其自身折叠的动态过程及其对组装程序的指导作用被相对忽视。那么，rRNA是否不仅仅是支架？它能否通过自身有序的折叠，像一份“蓝图”一样，主动指导并调控整个核糖体的组装进程？这正是Kai Sheng博士在其获奖论文研究中致力于回答的核心问题。

为了回答这一根本性问题，Kai Sheng开展了一系列创新性的研究，其成果发表在《Biophysical Journal》上。他的研究范式实现了从以蛋白质为中心到以RNA为中心的转变，通过开发和应用前沿的生物物理与化学生物学技术，首次以前所未有的分辨率描绘了细菌核糖体大亚基（large subunit）的组装路径，并提出了“RNA折叠子”（RNA foldons）这一新概念，深刻揭示了RNA结构在驱动分子自组装中的核心作用。

研究者主要运用了几项关键技术方法：首先是开发了非监督迭代亚分类冷冻电镜（unsupervised iterative subclassification cryo-EM）分析流程，用于从高度异质的样本中解析低丰度的核糖体组装中间体结构；其次，创建了基于反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）的体外重构 assay，特异性扰动rRNA的局部折叠，从而捕获早期组装停滞中间体；第三，在活细胞内构建了基于催化失活型CRISPR-Cas13（dCas13）的RNA可及性（accessibility）探测系统，实现了在单核苷酸分辨率下实时监测rRNA在动态组装过程中的结构变化。研究样本主要来源于细菌模型。

从蛋白质视角到RNA视角的转变

研究伊始，Kai Sheng首先从传统的蛋白质中心视角入手。他利用冷冻电镜（cryo-EM）分析了在不同扰动条件下（如核糖体蛋白敲除、抗生素处理、低温生长）纯化得到的核糖体组装中间体集合。这些数据确实揭示了一系列结构中间体，但也暴露了极端的结构异质性，使得传统的单颗粒分析技术难以应对。为此，他开发了一套创新的计算框架，包括非监督迭代亚分类方法，能够从复杂的数据集中提取出通常被忽略的低丰度状态；同时还建立了体积分割和基于图论（graph-based analysis）的分析方法，用以识别协同的结构元件及其相互关系。应用这一框架，特别是在分析缺乏DEAD-box RNA解旋酶AdeaD的菌株在19°C低温下的组装中间体时，他成功解析了迄今在细菌中捕获的最早的大亚基组装中间体结构。该研究首次发现，尽管在成熟的大亚基中各个RNA结构域紧密缠绕，但在组装早期，这些结构域能够独立折叠。这项早期工作发表于《自然·通讯》（Nat Commun.）。

开发RNA中心的研究工具：反义寡核苷酸（ASOs）

对早期中间体的观察激发了Kai Sheng更深入的好奇：rRNA可能不仅仅是被动支架，而是主动驱动组装的“蓝图”。为了验证这一假说，需要一种能够特异性扰动rRNA特定区域的方法。他转而开发了一种以RNA为中心的新策略——利用反义寡核苷酸（ASOs）。这些经过设计的短链核酸能够像“路障”一样，精准地结合到rRNA的特定序列区域，阻碍该区域的正确折叠或与蛋白质的结合。通过在体外核糖体重构体系（in vitro reconstitution assay）中筛选数十种ASOs，他鉴定出十种能有效将组装过程阻滞在非常早期、以往难以企及的阶段的ASO。随后，他利用生化分级分离技术富集这些被阻滞的中间体，并运用之前开发的cryo-EM流程对其组成和结构进行解析。

揭示新的组装图谱与“RNA折叠子”概念

结果令人震惊。通过分析这些ASO捕获的中间体，研究共发现了38个新的细菌核糖体大亚基组装中间体，极大地扩展了已知的组装图谱，其精细程度达到了单个RNA螺旋（RNA helix）的水平。这使得研究人员能够首次清晰地观察到rRNA特定区域按顺序折叠的详细过程，以及这种折叠如何精确地指导核糖体蛋白的招募。基于这些发现，Kai Sheng提出了“RNA折叠子”（RNA foldons）的概念。这些“折叠子”是rRNA上能够独立且依次折叠的离散结构单元，类似于蛋白质折叠中的“折叠子”（protein foldons）。它们作为模块化的构建块，逐步引导核糖体的复杂组装。尤为重要的是，研究识别出一个关键中间体，在该中间体中，所有独立的RNA结构域均已折叠完成，但尚未相互对接形成一个功能整体。这表明在核糖体组装中，结构域内的折叠（intradomain folding）先于结构域间的组装（interdomain assembly）。这项重要发现已投稿至《自然·通讯》（Under revision at Nat Commun.）。

在活细胞中实时探测RNA组装动态

尽管体外研究提供了深刻的机制见解，但Kai Sheng进一步希望了解在活细胞的动态环境中，组装过程是如何被调控的。为此，他采用了可编程的RNA靶向系统——CRISPR-Cas13技术。通过将催化失活的Cas13蛋白（dCas13）与一个覆盖整个rRNA操纵子（rRNA operon）的高密度向导RNA（guide RNA）文库相结合，他构建了一个活细胞探测系统。该系统能够在单核苷酸分辨率下，实时探测rRNA在组装过程中的结构可及性（accessibility）。利用这一dCas13/sgRNA平台，他绘制了不同rRNA区域在组装动力学窗口内从暴露到被埋藏的动态图谱，并揭示了在抗生素胁迫或遗传扰动下这些可及性模式的改变。研究发现，长的RNA螺旋比紧凑的短发夹结构更易被靶向，并且结构上易受攻击的区域与细菌生长受抑制相关。这不仅为研究核糖体组装提供了强大工具，也为开发靶向RNA的新型抗生素策略开辟了道路。

Kai Sheng博士的这项研究具有多重重要意义。首先，它从根本上改变了我们对核糖体组装机制的理解，将关注点从蛋白质辅助因子转移到了RNA本身的有序折叠上，确立了RNA作为组装过程“主导者”的关键地位。其次，提出的“RNA折叠子”概念为理解复杂RNA-蛋白质复合物的组装提供了一个普适性的框架，可能适用于更广泛的分子生物学领域。在技术层面，所开发的非监督cryo-EM分析流程、ASO扰动策略和活细胞dCas13探测系统，为RNA结构生物学和动态过程研究提供了强大的方法论工具包。最后，这项研究具有明确的转化医学价值。通过揭示核糖体RNA组装过程中的脆弱环节，为开发针对病原菌的新型抗生素（即靶向核糖体组装过程的抗生素）提供了全新的靶点和思路，有望应对日益严峻的抗生素耐药性问题。

总而言之，这项由Kai Sheng完成的研究，通过巧妙的实验设计和前沿的技术手段，逐层揭开了生命构建其蛋白质工厂的神秘面纱，强调了RNA折叠在分子自组装中的核心驱动力作用。它不仅深化了我们对基本生命过程的认识，也为未来的生物技术开发和新型药物设计奠定了重要的科学基础。