综述：突触囊泡糖蛋白2抗惊厥和肉毒杆菌神经毒素结合的分子机制

《TRENDS IN Neurosciences》：Molecular insights into anticonvulsant and botulinum neurotoxin binding of synaptic vesicle glycoprotein 2

本综述系统总结了冷冻电镜（cryo-EM）技术揭示的突触囊泡糖蛋白2（SV2）家族结构与功能的最新突破。文章重点阐述了SV2A作为抗癫痫药物（如左乙拉西坦）的特异性靶点，以及SV2蛋白作为多种肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A、D、E、F）受体的双重角色，详细解析了药物和毒素结合的分子模式、变构调节机制及BoNT/A1在结合SV2后发生的构象变化及其对毒素转运的启示。这些发现为神经系统疾病治疗和毒素作用机制研究提供了重要理论依据。

　　

SV2蛋白家族：抗惊厥药物的靶点与BoNTs的受体

SV2蛋白家族包括SV2A、SV2B和SV2C三个成员，它们属于溶质载体22（SLC22）家族，是推定转运蛋白，对神经系统功能至关重要。SV2A基因敲除小鼠会出现严重癫痫并早期死亡，凸显了其在神经传递中的关键作用。SV2蛋白与多种神经系统疾病相关，如癫痫、精神分裂症以及阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病。尽管其精确的生理功能尚不完全清楚，但研究提示这些蛋白在囊泡功能中扮演多重角色。其最明确的功能是：(i) SV2A作为抗惊厥药物的特异性靶点；(ii) SV2蛋白作为多种肉毒杆菌神经毒素（BoNTs）的受体。

SV2A和SV2B的结构特征

近期冷冻电镜研究解析了SV2A和SV2B的高分辨率结构。这些蛋白包含一个胞外结构域（或腔内结构域）、一个跨膜结构域（TMD）以及一个胞质螺旋束。TMD由十个跨膜螺旋（TM1-TM10）组成，形成四个三螺旋重复单元。两个独立研究报道了在TM1-2环和连接TM8与腔内结构域的连接子之间保守半胱氨酸残基可形成二硫键。该二硫键可能允许腔内结构域作为杠杆控制转运通路中腔内空腔的开启或关闭。支持这一假设的是，抗惊厥药物诱导的TM1-2区域构象变化可导致腔内空腔关闭。然而，重组SV2A的质谱分析未能检测到该二硫键，且半胱氨酸突变不影响其表达或折叠，因此其功能相关性尚不明确。

此外，有研究报道SV2A可形成二聚体。在一个结构中，二聚体界面主要由TM8和TM10形成，而在另一个结构中，则由位于腔内结构域N端区域的一个暴露β-链介导。有趣的是，同一条β-链也被认为与破伤风神经毒素（TeNT）结合有关。这两种相互作用都类似于在淀粉样原纤维中观察到的链间相互作用，后者与阿尔茨海默病和帕金森病等疾病相关。通常，蛋白质会避免此类易于聚集的开放β-片层边缘。这提示腔内结构域的二聚化或TeNT与该位点的结合（可能由于纯化所用的pro-macrobody阻塞了BoNT/A的经典结合位点）可能是该暴露β-链引起的人为假象。此外，尚不清楚SV2-TeNT相互作用是否由在SV2A-TeNT界面附近观察到的去垢剂分子所稳定。这些相互作用是否是蛋白质纯化的副产物仍有待确定。

SV2蛋白与有机阳离子转运蛋白（同属SLC22家族）具有最高的结构相似性。值得注意的是，有机阳离子转运蛋白表现出相似的结构域架构，包含一个胞外结构域、一个TMD和一个胞质螺旋束样结构。与SV2蛋白类似，有机阳离子转运蛋白的胞外结构域含有糖基化位点。在SV2A和SV2B中，三个预测的N-糖基化位点已被证实对于这些蛋白正确运输至突触囊泡至关重要。这种与有机阳离子转运蛋白的结构相似性可能为理解SV2功能提供有价值的线索。与有机阳离子转运蛋白类似，SV2蛋白推定的底物转运通路包含保守的带负电荷残基，提示SV2蛋白也可能转运带正电荷的底物。支持这一观点的是，在这些残基附近观察到了未定义的密度，可能对应于结合的阳离子。该区域与有机阳离子转运蛋白中确定的底物结合位点相吻合。

抗惊厥药物与SV2蛋白结合的结构基础

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，其特征是大脑异常电活动导致的反复发作。多种抗惊厥药物已被批准用于治疗不同类型的癫痫发作和癫痫综合征。这些药物通过增强抑制性神经传递或抑制兴奋性信号等多种机制发挥作用，以帮助稳定神经活动并预防发作。左乙拉西坦（levetiracetam）及其类似物布瓦西坦（brivaracetam）代表了一类独特的抗惊厥药物。它们通过选择性结合SV2A（不与相关的SV2B或SV2C异构体相互作用）来发挥其作用。通过这种特异性结合，左乙拉西坦和布瓦西坦调节兴奋性神经递质谷氨酸的释放，从而有助于减少癫痫发作活动。帕塞诺尼（padsevonil）正在被开发作为癫痫患者（特别是那些患有耐药性癫痫发作的患者）的替代治疗选择。与左乙拉西坦和布瓦西坦不同，帕塞诺尼可与所有三种SV2异构体结合，这可能提供更广泛的治疗潜力。UCB7361和UCB-2500与帕塞诺尼相关，而UCB-J是一种靶向SV2A的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂。

近期，多个冷冻电镜结构被解析，显示了SV2A与左乙拉西坦、布瓦西坦、UCB-2500、UCB7361和UCB-J的结合，以及SV2B与帕塞诺尼的结合。所有结构共享相似的整体架构，但在涉及帕塞诺尼、UCB-2500、UCB7361和UCB-J的结构中，跨膜螺旋1（TM1）的腔内部分采取了更闭合的构象。配体结合口袋由四个三螺旋跨膜重复单元（TM1、TM4、TM7和TM10）的第一个螺旋在TMD核心形成。在药物结合状态下，SV2A和SV2B均采用向外开放的转运蛋白样构象。在此构象中，一个双酪氨酸基序（SV2A中的Y461和Y462，SV2B中的Y404和Y405）充当下部的腔内门控，根据结构的不同，可观察到其处于开放或关闭状态。因此，结合腔的上部仍可从腔内侧进入，而从胞质侧的进入则被胞质螺旋束阻断。这些抗惊厥药物共享的结合位点主要由芳香族残基组成。结合口袋中的额外相互作用解释了布瓦西坦对SV2A的亲和力高于左乙拉西坦的原因。有趣的是，这些残基几乎在所有SV2异构体中都是保守的，但只有SV2A结合左乙拉西坦和布瓦西坦，这表明异构体特异性不能仅由结合位点解释。目前的结构理解也未能完全解释这些药物如何作用于SV2A。一种可能性是抗惊厥药物通过将SV2A稳定在向外开放的构象，从而抑制其推定的转运功能。然而，这些药物是否也能结合处于向内开放构象的SV2蛋白仍有待确定。

抗惊厥药物与SV2A结合的变构调节

变构调节通过实现选择性蛋白质靶向、生物反应的微调、新的治疗策略和改善的安全性，在药物发现和开发中具有重要前景。UCB1244283已被鉴定为一种正变构调节剂，可增强左乙拉西坦和布瓦西坦与SV2A的结合。值得注意的是，UCB1244283可以独立于左乙拉西坦或布瓦西坦而结合SV2A，并在体内对强直性和阵挛性癫痫发作表现出保护作用。近期对SV2A-布瓦西坦-UCB1244283和SV2A-左乙拉西坦-UCB1244283复合物的冷冻电镜研究表明，UCB1244283通过占据主配体结合口袋相邻的腔内空腔中的一个次级位点来增强布瓦西坦和左乙拉西坦的结合。该变构位点由疏水和不带电荷的残基组成。在此变构位点的结合似乎阻断了腔内出口通路，减少了左乙拉西坦或布瓦西坦的解离，从而提高了它们的有效结合。虽然与单独结合布瓦西坦或左乙拉西坦的SV2A结构相比，未观察到大规模的构象变化，但在主结合位点、变构位点和TMD的腔内区域检测到了细微但重要的变化。其中最显著的构象变化发生在TM1和TM8的腔内部分，这导致两个大体积芳香族残基的重新定向。这些变化进一步稳定了腔内前庭的闭合构象，有助于药物的捕获效应。

有趣的是，UCB1244283可以在左乙拉西坦或布瓦西坦存在下与SV2A结合，但不能与其他化合物如帕塞诺尼结合。结构数据表明，较大的帕塞诺尼和UCB1244283同时结合会导致空间冲突，这解释了其选择性。为了探索UCB1244283结合的结构基础，研究人员检查了其与UCB-J和UCB7361（这些配体与帕塞诺尼一样，比左乙拉西坦和布瓦西坦更大）的相互作用。比较SV2A与UCB-J、UCB7361和UCB-2500结合以及SV2A与布瓦西坦和左乙拉西坦结合的冷冻电镜结构，证实只有当主位点配体不与变构位点重叠时，UCB1244283才能结合。主位点的结合重塑了腔内跨膜区域，通过使TM1在开放和关闭状态之间转换并重新定位关键残基来控制UCB1244283的进入。UCB1244283与SV2A-布瓦西坦结合产生的复合物与SV2A与UCB-2500、UCB-J和UCB7361形成的复合物非常相似。

尽管UCB1244283具有机制研究价值，但由于其溶解性差，不适合作为治疗剂。然而，从这些研究中获得的结构见解为开发靶向SV2A的临床可行的正变构调节剂提供了一个有价值的框架。

BoNT/A1在溶液中呈现独特构象

BoNT/A1和BoNT/B1的首批晶体结构揭示了一种“开放构象”，其中催化结构域和受体结合结构域被转运结构域分隔开，后者通过“腰带”环绕催化结构域并延伸成一个螺旋区域。相比之下，BoNT/E和TeNT的结构显示出更紧凑的“闭合构象”，催化结构域和受体结合结构域位于转运结构域的同一侧，使得所有三个结构域之间能够发生相互作用。这种意想不到的结构排列导致了一种假设，即BoNT/E的紧凑构象可能是其作用起效比BoNT/A1更快的原因。因此，有人提出BoNT/A1和BoNT/B1可能在转运过程中经历从开放状态到闭合状态的构象转变。这些结构差异特别令人感兴趣，因为BoNT/A1以及在较小程度上的BoNT/B1是使用最广泛的治疗性蛋白质之一。此外，BoNT/E目前正由Ipsen和AbbVie等公司进行临床研究。然而，对BoNT构象状态的详细研究一直受到限制，因为未结合毒素的晶体结构在结晶时不受pH影响且始终呈现相同构象。TeNT是一个例外，观察到了其pH依赖的构象转换。

冷冻电镜的最新进展使得能够在溶液中对BoNTs进行结构分析。对于BoNT/B和BoNT/E，冷冻电镜结构与之前通过X射线晶体学确定的结构非常匹配。然而，BoNT/A1的冷冻电镜结构揭示了一个意想不到的“半闭合”构象，该构象与其晶体结构中看到的开放排列显著不同。这种半闭合状态似乎是BoNT/A1在溶液中的主要形式，尽管该毒素也采样了广泛的构象范围，包括开放状态。这种结构变异性突出了受体结合结构域的高流动性和灵活性。

SV2-BoNT受体-毒素复合物结构

SV2是BoNT A、D、E和F的蛋白质受体。这些毒素的结合位点已被定位于SV2的腔内结构域。在冷冻电镜用于高分辨率结构确定之前，结构见解仅限于通过X射线晶体学解析的单个毒素-受体结构域复合物。可用的结构数据包括BoNT/A与SV2C的复合物以及一个嵌合SV2Ac腔内结构域与BoNT/E的复合物。五个BoNT/A-SV2C晶体结构中的四个显示出高度相似的结合模式，其中BoNT/A结合SV2C腔内结构域C端β-链的开放边缘。这种相互作用导致毒素受体结合结构域凸面上的一个发夹环中的两条β-链被纳入，从而扩展了β-螺旋结构的一个面。通常，蛋白质会避免此类易于聚集的开放β-片层边缘，以最小化细胞损伤的风险。BoNT/A以及可能的其他BoNTs似乎已经进化到利用SV2蛋白中的这种结构脆弱性来进入神经元。

一种独特的结合模式解释了为什么BoNT/E与SV2A和SV2B相互作用，但不与SV2C相互作用。与BoNT/A不同，BoNT/E通过其受体结合结构域的C端亚结构域与SV2A的β-螺旋束侧面相互作用。在这些研究中，使用了一个结合了SV2A和稳定化SV2C序列、并保留SV2A样结合特性的嵌合腔内结构域（SV2Ac）。为了加强与SV2A的相互作用，一个模拟神经节苷脂结合特征的纳米抗体被融合到腔内结构域上。SV2Ac-BoNT/E复合物的冷冻电镜结构也揭示了一种独特的聚糖结合相互作用：BoNT/E结合到一个末端唾液酸，该唾液酸可能源自与BoNT/A结合中涉及的同一聚糖。突变研究表明，蛋白质-蛋白质和蛋白质-聚糖相互作用对BoNT/E的功能都至关重要。

近期的冷冻电镜研究报道了全长SV2A与BoNT/A2的受体结合结构域以及TeNT的复合物结构，以及全长SV2B与全长BoNT/A1或其受体结合结构域结合的结构。SV2-BoNT/A结构证实了先前在BoNT/A-SV2C晶体结构中观察到的结合模式。

与BoNT/A相反，TeNT的受体结合结构域结合SV2A腔内结构域的N端而非C端。虽然整体结合类似于BoNT/A，但TeNT的β-发夹以平行而非BoNT/A1和A2中观察到的反平行方向结合第二个暴露的N端β-链。与BoNT/A类似，界面主要是骨架介导的，并伴有额外的侧链接触。未观察到与三个SV2A N-聚糖的相互作用，这与突变数据一致，但不同于依赖聚糖的BoNT/A相互作用。两个共纯化的神经节苷脂证实了在生理条件下与R位点的结合。然而，TeNT-SV2相互作用的功能相关性尚不清楚，因为TeNT主要通过逆行轴突运输而非突触囊泡循环被内化。巢蛋白和受体型蛋白酪氨酸磷酸酶已被鉴定为替代的TeNT受体。

BoNT/A亚型与SV2蛋白的保守结合模式

来自与所有三种SV2异构体结合的BoNT/A亚型的结构数据为毒素-受体相互作用提供了详细的见解。SV2和BoNT/A之间的结合界面主要通过骨架-骨架氢键稳定。除了这些相互作用外，在复合物结构中也观察到了特定的侧链-侧链接触。

对这些结构的分析揭示了两个不同且保守的区域，它们介导BoNT/A和SV2蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用。第一个是TTxxY基序（其中‘x’代表任何氨基酸），该基序在所有BoNT/A亚型中都是保守的。该基序似乎在定向N-聚糖、稳定毒素的发夹环结构以及促进受体结合方面起着至关重要的作用。更多详细信息请参阅Box 1。

第二个相互作用位点集中在大多数BoNT/A亚型的第1156位残基（对应于BoNT/A3和BoNT/A8中的第1152和1157位残基）。该区域与三维结构中的邻近残基一起，与SV2蛋白形成特异性接触。值得注意的是，相互作用位点的残基在亚型之间并不保守，表明BoNT/A在受体界面进化出了结合灵活性。这种适应性可能允许毒素通过多样的侧链相互作用来结合所有SV2异构体。

BoNT/A亚型中蛋白质-碳水化合物相互作用的保守性

糖基化在BoNT/A与其受体的相互作用中起着至关重要的作用。比较现有的BoNT/A与糖基化SV2蛋白结合的结构表明，界面处蛋白质-碳水化合物相互作用的整体模式是保守的。所有结构都显示一个与天冬酰胺残基连接的N-聚糖，包含两个N-乙酰葡糖胺和一个岩藻糖，它们与毒素形成广泛的接触。此外，在SV2B聚糖中可见三个甘露糖，在SV2C中可见一个。该相互作用的一个关键特征是毒素中的一个苯丙氨酸残基（F953）与第一个N-乙酰葡糖胺的糖环之间存在TT-CH堆叠。该苯丙氨酸的突变完全消除了受体结合，突显了此相互作用的重要性。值得注意的是，聚糖-蛋白质相互作用对BoNT/A1与SV2B结合的贡献似乎大于对SV2C的贡献，因为即使在缺乏糖基化的情况下，SV2C-BoNT/A1复合物仍保持稳定。

BoNT/A的SV2结合区域在其他毒素中不保守

SV2-BoNT/A复合物的结构分析表明，结合模式在所有三种SV2异构体中都是保守的。相比之下，BoNT/E采用独特的结合模式，仅与SV2A和SV2B相互作用，而不与SV2C相互作用。这种差异反映在BoNT/E的发夹环比BoNT/A1短，导致TTxxY基序的缺失。此外，BoNT/A1中参与与第一个N-乙酰葡糖胺TT-CH堆叠的苯丙氨酸残基在BoNT/E中不保守，这导致了其独特的碳水化合物结合特征。

同样，TeNT采用独特的SV2结合模式，这与保守的TTxxY基序的缺失一致。此外，介导与SV2的N-聚糖相互作用的苯丙氨酸残基也缺失，这与观察到的TeNT不结合碳水化合物的事实相符。

目前，BoNT/D和BoNT/F与SV2蛋白相互作用的机制在很大程度上仍然未知。一项最近的分子动力学研究表明，BoNT/F仅与SV2的碳水化合物部分相互作用。这与TTxxY基序的缺失以及存在一个结合N-乙酰葡糖胺的苯丙氨酸残基相符。它也支持了实验数据，表明BoNT/F可以结合所有三种SV2异构体。BoNT/D中TTxxY基序和苯丙氨酸残基的缺失表明，它可能像BoNT/E一样，以不同于BoNT/A的方式结合SV2。此外，由于其关键相互作用残基缺乏保守性，它的结合模式很可能也与BoNT/E不同。

BoNT/A1的构象变化

冷冻电镜使得能够在两种构象状态下对BoNT/A1进行结构表征。在受体结合后，BoNT/A1出乎意料地从半闭合构象转变为开放的线性构象。在这种开放状态下，受体结合结构域和催化结构域定位在远离膜的位置，表明这种排列方式与转运不相容。因此，开放构象可能代表毒素在神经元表面或突触囊泡内酸化之前的受体结合形式。第二个主要的构象变化发生在pH 5.5时，这模拟了酸化后突触囊泡的环境。在这些条件下，受体结合的毒素切换回半闭合构象。这种重排使催化结构域、腰带和转运结构域靠近膜，支持了需要一个紧凑的、具有转运能力的状态才能成功将催化结构域递送到神经元胞质中的模型。

近期研究表明，BoNT/A1的催化结构域可以通过膜定位结构域和N端区域稳定地与神经元质膜的胞质面结合。在低pH冷冻电镜结构中，N端和膜定位结构域内的两个环