通过光谱分析和微尺度热泳技术发现硫半卡巴唑衍生物作为有前景的SARS-CoV-2 Mpro抑制剂

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Discovery of thiosemicarbazone derivatives as promising SARS-CoV-2 Mpro inhibitors by spectroscopy and microscale thermophoresis

本研究设计并合成了29种噻嗪酮衍生物，作为SARS-CoV-2主蛋白酶（Mpro）抑制剂。其中4种化合物（1e、2c、2f、3a）IC50值分别为5.97±0.98、4.43±1.67、10.99±2.39、28.88±3.57 μM，显示显著抑制活性。通过荧光光谱、分子对接、微流控热迁移及分子动力学模拟，揭示了化合物与Mpro的静态淬灭、氢键及疏水相互作用机制，为新型Mpro抑制剂开发提供依据。

　　

薛星|陈乐瑶|张淼|常晓宇|王瑞勇

郑州大学平远实验室化学学院，中国郑州450001

摘要

自COVID-19爆发以来，筛选SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）的抑制剂已成为一项关键策略。Mpro对病毒复制至关重要，也是治疗开发的关键靶点。在这项工作中，我们报告了29种硫代半卡巴唑衍生物的设计和合成。酶抑制实验表明，27种化合物对Mpro具有抑制活性，其中4种化合物（1e、2c、2f、3a）表现出显著的抑制效力，其IC₅₀值分别为5.97?±?0.98?μM、4.43?±?1.67?μM、10.99?±?2.39?μM和28.88?±?3.57?μM。荧光光谱、分子对接、微尺度热泳和分子动力学模拟被用于分析硫代半卡巴唑衍生物与Mpro之间的相互作用机制。荧光结果表明，这些化合物在Mpro上的荧光猝灭机制主要是静态猝灭。结合过程中观察到了氢键和疏水相互作用。微尺度热泳结果证实，化合物1e、2c和2f对Mpro具有显著的结合亲和力，其K_d值分别为4.21?±?0.35?μM、3.24?±?0.28?μM和24.26?±?1.82?μM。本研究为理解硫代半卡巴唑衍生物与Mpro之间的相互作用机制提供了有价值的信息，并为新型Mpro抑制剂的研究提供了见解。

引言

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行仍然对人类健康构成长期威胁。^1,2迄今为止，该疾病已导致数百万人死亡，并造成了严重的全球经济损失。³与其他冠状病毒类似，SARS-CoV-2主要攻击呼吸系统，引发严重的肺炎，尤其是老年人和免疫功能低下者通常需要呼吸支持和重症监护。^4,5尽管已经开发出一些疫苗，但这种病毒性疾病所带来的挑战尚未得到根本解决。⁶因此，迫切需要开发更有效的抗病毒药物。

< />⁷该病毒的基因组长度约为26–32?kb，编码一些结构蛋白、非结构蛋白和辅助蛋白。pp1a和pp1ab多聚蛋白切割成单一的非结构蛋白是病毒复制过程中的一个关键步骤，而主要蛋白酶（Mpro）在此过程中起着至关重要的作用。^8,9SARS-CoV-2 Mpro抑制剂可以阻止病毒成熟，由于人类体内没有相关的蛋白酶，因此活性位点抑制剂通常不会对患者产生毒性。此外，Mpro在冠状病毒中高度保守，使其成为开发泛冠状病毒治疗药物的有希望的靶点。^{10,11 Mpro是一个由两个亚基组成的同源二聚体，这两个亚基相互垂直排列。12,13这两个亚基通过一个亚基的Ser1与另一个亚基的Phe140和Glu166之间的相互作用连接。8,1433.8?kDa的Mpro是一种亲核半胱氨酸蛋白酶，包含三个结构域：I（残基8–101）、II（102–184）和III（201–306）。15前两个结构域负责蛋白质的结构，最后一个结构域负责催化过程。16在活性位点，Cys145和His41形成一个催化二聚体。半胱氨酸的巯基（-SH）负责水解反应，而His41提供了激活-SH基团的最佳pH条件，从而实现对底物的亲核攻击。17 结构为(NHC(S)NHN)的化合物被称为硫代半卡巴唑，这是化学、生物和制药领域中一类重要的化合物。硫代半卡巴唑具有多种生物和药用特性，如抗菌、18抗真菌、19、20、抗氧化、21、22、抗HIV、24、抗惊厥、18、25、抗病毒、26、抗癌、27、酶抑制和细胞毒性18,19。 在这项工作中，设计并合成了一系列29种硫代半卡巴唑（图1）。这些产品的化学结构通过1H NMR、13C NMR和HRMS进行了表征。选择了四种代表性的硫代半卡巴唑来评估它们与Mpro的结合情况。通过荧光光谱、分子对接、分子动力学模拟和微尺度热泳分析了这四种硫代半卡巴唑与Mpro的相互作用。这些数据为基于硫代半卡巴唑骨架设计Mpro抑制剂提供了结构上的见解，并为进一步开发这类抑制剂提供了潜在策略。}

章节摘录

硫代半卡巴唑的合成

硫代半卡巴唑衍生物的合成路线如图1所示。所有化合物都是通过两步亲核反应使用商业底物合成的。如图1所示，各种商业异氰酸酯与肼水合物反应生成硫代半卡巴唑中间体，然后这些中间体与取代的芳香醛缩合，得到化合物1a–h、2a–2g、3a–3h和4a–4f。合成的硫代半卡巴唑衍生物的化学结构如图所示

材料

所有化学材料均从Energy Chemical购买，无需进一步纯化。主要蛋白酶（Mpro）按照先前描述的程序进行表达，制备成0.3?mg/mL的Tris-HCl缓冲液储存在?80?°C下。⁶³¹H NMR和¹³C NMR谱（在DMSO?d₆中）在25?°C下使用Bruker光谱仪在400?MHz和100?MHz频率下测量。分裂模式分别用s（单峰）、d（双峰）、dd（双峰的双峰）和t表示

结论

在这项工作中，设计并合成了29种硫代半卡巴唑衍生物作为潜在的Mpro抑制剂。通过酶抑制实验确定了这些衍生物对Mpro的半最大抑制浓度（IC₅₀）。结果表明，27种化合物对Mpro具有抑制活性，其中4种化合物（1e、2c、2f、3a）表现出显著的抑制效力。Mpro与这四种硫代半卡巴唑衍生物之间的相互作用机制

作者贡献

薛星、陈乐瑶和张淼进行了研究工作。薛星提供了蛋白质。王瑞勇设计了研究方案。薛星和王瑞勇共同撰写了论文。

作者贡献声明

薛星：撰写——初稿；实验研究。陈乐瑶：实验研究。张淼：数据分析。常晓宇：资源准备。王瑞勇：撰写——审阅与编辑。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：王瑞勇报告称获得了国家自然科学基金的支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号：82130103）提供的财务支持。