《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Structural diversity of full-length human αvβ3 integrin revealed by cryo-EM
编辑推荐：
本研究通过高分辨率冷冻电镜解析了人整合素αvβ3的apo及配体结合态结构，揭示了连续构象变化机制，发现新型抑制剂CWHM-12通过共存关闭与开放抑制态实现差异化调控，为精准靶向药物设计奠定基础。
Cang Wu|Yuanzhu Gao|Weiyan Wang|Zhoufang Li|Qing Shu|Xi Zhang
南方科技大学生命科学学院，中国广东省深圳市518055
摘要
整合素是重要的跨膜受体，负责调控细胞黏附、迁移和存活，并已成为治疗癌症、纤维化和自身免疫性疾病的有希望的靶点。然而，由于疗效有限和意外的脱靶效应，大多数针对整合素的药物在临床试验中都失败了，这反映了人们对整合素构象调控机制的理解还不够充分。在这里，我们通过收集大量数据，获得了人类整合素αvβ3在无配体（apo）状态和配体结合状态下的高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构。结果，我们解析出了六种整合素的无配体状态构象（其中五种此前尚未被描述），以及五种不同的配体结合状态构象，从而揭示了整合素激活过程中的构象转变连续性。值得注意的是，CWHM-12能够使整合素同时存在于关闭状态和开放状态，其机制与传统基于RGD肽的抑制剂有根本不同。我们的研究为理解整合素激活的多样性提供了结构框架，并为设计具有更高精度和更低脱靶效应的下一代抑制剂奠定了基础。
引言
整合素是介导细胞与细胞外基质相互作用的跨膜受体，在免疫反应、组织修复和肿瘤进展等过程中起着关键作用[[1], [2], [3]]。作为由18个α亚基和8个β亚基组成的异二聚体，整合素可以组装成24种不同的受体形式，每种受体都具有保守的“头部-腿部-尾部”结构，并具有受调控的构象动态（图S1）[1,4,5]。这些特性使得整合素成为治疗癌症、纤维化和自身免疫性疾病的理想靶点。目前，针对整合素受体的抑制剂开发取得了显著进展，尤其是那些以关键结合肽为基础的抑制剂[[6], [7], [8], [9], [10], [11]]。根据这些抑制剂对受体构象变化的影响，它们可以被分为两类：一类是稳定关闭/非活性状态的抑制剂（关闭型抑制剂），另一类是诱导开放/活性状态的抑制剂（开放型抑制剂）[6]。尽管已经开发出了许多小分子整合素抑制剂，如Cilengitide TFA、Cyclo(-RGDfK和CWHM-12，但由于疗效有限和脱靶效应，大多数候选药物在临床试验中都失败了[[9], [10], [11]]。一个主要挑战在于对整合素激活机制的结构性理解还不够完善，特别是从弯曲构象到伸展构象的动态转变[[12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19]]。此外，尽管之前的研究已经表明存在中间态，但迄今为止尚未获得含有“腿部”部分的高分辨率结构，尤其是在使用全长蛋白质进行结构分析时。目前还不清楚这些中间态如何响应药物配体。在这里，我们报告了人类整合素αvβ3在无配体状态和配体结合状态下的高分辨率冷冻电镜结构，发现了五种之前未被认识的中间构象，为下一代靶向小分子药物的合理设计提供了详细的结构基础。
部分内容摘录
整合素αvβ3在无配体状态下的多个冷冻电镜结构
我们表达了全长的人类整合素αvβ3复合物，并首次确定了其经典的弯曲-关闭构象的高分辨率结构（图1A，构象1；图S2-S3）。有趣的是，我们的初步二维分类揭示了一种此前未被描述的四聚体构象（图1A，构象1；图S2-S3）。虽然我们不知道其生理意义，但这在当时仍然是一个非常有趣的发现。
讨论
更深入地理解整合素的动态特性和多样性对于开发针对这一复杂受体家族的下一代药物至关重要。我们的结构分析表明，整合素αvβ3存在于多种构象状态中，包括由不同配体诱导的无配体中间态和半激活/完全激活形式。此外，我们还揭示了RGD型抑制剂和非RGD型抑制剂在调节整合素激活机制上的差异。
蛋白质表达与纯化
全长的人类整合素αv亚基（带有3个Flag标签）和β3亚基（带有strep II亲和标签，其他α和β亚基没有亲和标签）被亚克隆到pCDNA3.1表达载体中。这些受体由HEK293F细胞表达，细胞在37°C下培养于SMM-293 T-II表达培养基（Sino Biological）中。当细胞密度达到2–3×10^6个细胞/毫升时，用1毫克/升的无内毒素质粒（与聚乙烯亚胺以1:3的比例混合）对细胞进行瞬时转染。CRediT作者贡献声明
Cang Wu：撰写初稿、验证数据、资源管理、方法设计、数据分析、概念构思。Yuanzhu Gao：概念构思。Weiyan Wang：撰写与编辑、数据分析。Zhoufang Li：撰写初稿、项目管理、资金获取。Qing Shu：撰写与编辑、资金获取。Xi Zhang：撰写与编辑、撰写初稿、验证数据、监督研究、资金获取。
资助
本项目主要得到了深圳市科技创新发展基金的支持（项目编号：KCXFZ20201221173208023-1039027）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
我们衷心感谢Tianzi Wei博士在稿件完善方面提供的宝贵帮助。同时，我们也感谢南方科技大学（SUSTech）的冷冻电镜中心和核心研究设施在数据收集与分析方面的支持。
