《TRENDS IN Biotechnology》：Creating artificial miR2118a/b to boost yield and broad-spectrum resistance in soybean via CRISPR/Cas9-targeted mutation
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本研究利用CRISPR/Cas系统编辑大豆miR2118a/b的5'端，成功构建无转基因amiR2118a/b双突变体。田间试验表明，突变体在病原菌感染条件下显著提高抗病性（如Psg、SCN、RKN）并增加产量，为作物改良提供了新策略。
技术成熟度
本研究提出了一种便捷且可靠的方法，通过利用 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas9) 系统对大豆中的 miRNAs 进行突变，从而生成用于大豆改良的人工 miRNAs（amiRNAs）。该技术的当前技术成熟度（TRL）为 4-5 级。在 TRL 4 级时，实验室和受控环境中的数据证实了核心机制：amiR2118a/b 突变体表现出 pre-amiR2118a/b 的二级结构改变，成熟 miR2118a/b 和 phasiRNAs 的水平降低；在正常条件下以及受到 Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg) 感染的条件下，与生长和防御相关的基因表达上调；此外，这些突变体在温室环境中对 Psg、大豆胞囊线虫（SCN，种族 3/5）和根结线虫（RKN）具有增强的抗性，且不会抑制生长。在 TRL 5 级时，2023 至 2024 年在北京和汉川进行的田间试验表明，这些突变体的产量一致增加了 7.4–8.7%；使用从大庆采集的天然 SCN 感染土壤在温室中进行的盆栽实验显示，突变体中的 SCN 种群密度降低了 22.19–32.68%，同时产量没有下降，从而证明了实验室结果与实际农业生产情况之间的关联性。然而，当这项技术大规模应用时，可能会面临一些挑战，包括基因型依赖性、机制上的空白、田间病原体抗性的验证以及调控和育种过程的整合。这些挑战需要通过扩大基因型和作物测试范围、填补机制空白、进行高级田间验证以及优化调控和育种过程来加以解决。
亮点
miR2118 可以触发植物中 phasiRNA 的生物合成，在植物发育和抗病性方面具有多重作用。
通过 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas9) 系统靶向大豆 miR2118a/b 的 passenger 链（miR2118a/b-5p），成功创建了无转基因的 amiR2118a/b 突变体。
人工 miR2118a/b 双突变体表现出 pre-amiR2118a/b 的二级结构改变，同时抑制了成熟 miR2118a/b 和 phasiRNAs 的生物合成；在正常条件下以及受到 Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg) 感染的条件下，与生长和防御相关的基因表达上调。
两种无转基因的 amir2118a/b 双突变体对 Pseudomonas syringae pv. glycinea、大豆胞囊线虫和根结线虫表现出增强的抗性，并在无病原体的田间条件下实现了产量增加。
本研究提供了一种通过 CRISPR/Cas 系统对作物中的 miRNAs 进行突变来生成人工 miRNAs（amiRNAs）以改良作物的策略。
摘要
虽然成熟 miRNAs 的调控功能已经得到充分研究，但 miRNAs* 的功能及其在作物改良中的遗传工程潜力仍需进一步探索。在此研究中，我们利用 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein (Cas9) 系统编辑 miR2118a/b 的 5’ 链（miR2118a-b-5p），在大豆（Glycine max）中获得了多个 amir2118a/b 突变体。miR2118a-b-5p 的修饰改变了 pre-amiR2118a/b 的二级结构，并降低了成熟 miR2118a/b 的水平。这些 amir2118a/b 突变体仍能够引发 phasiRNAs 的生物合成，尽管其含量较野生型（WT）植物有所降低。此外，在正常条件下以及受到 Pseudomonas syringae pv. glycinea (Psg) 感染的条件下，这些突变体上调了与生长和防御相关的基因表达。值得注意的是，两种无转基因的 amir2118 突变体对 Psg、大豆胞囊线虫（SCN）和根结线虫（RKN）表现出增强的抗性，并在无病原体的田间条件下实现了产量增加。本研究提供了一种通过 CRISPR/Cas 系统对作物中的 miRNAs 进行突变来生成人工 miRNAs（amiRNAs）以改良作物的策略。
