基于MALDI-MSI空间脂质组学评估冷冻保存hiPSC来源肾脏类器官的细胞表型特征

《Heliyon》：Assessment of hiPSC-derived kidney organoids from cryopreserved progenitors using MALDI-MSI

本研究针对hiPSC来源肾脏类器官在冷冻保存后质量评估体系不完善的问题，开发了基于MALDI-MSI的空间脂质组学分析平台。研究人员通过冷冻保存第7天肾脏祖细胞并成功复苏分化，结合5μm高分辨质谱成像技术，系统比较了冷冻组(cKOR)与对照组(KOR)的细胞组成差异。结果表明冷冻后细胞存活率>94%，且能形成完整肾单位结构，脂质谱分析识别出10种细胞亚型，为干细胞衍生组织的质控标准建立提供了新技术支撑。

　　

在再生医学快速发展的今天，人类诱导多能干细胞(hiPSC)分化的肾脏类器官为终末期肾病患者带来了新的希望。这些三维培养的微小肾脏不仅能够模拟真实肾脏的结构和功能，更为药物筛选和疾病建模提供了理想平台。然而，要将类器官真正推向临床应用，还面临着标准化生产和长期保存的挑战。就像器官移植需要建立完善的器官库一样，类器官治疗也需要可靠的冷冻保存技术来保证随取随用。但问题在于，现有的质量评估方法主要依赖免疫荧光染色，这种方法只能同时检测少量标记物，难以全面反映类器官复杂的细胞组成。更棘手的是，传统的组织解离分析方法会破坏类器官的精细结构，让我们无法了解不同细胞类型的空间分布关系。

为了解决这些难题，来自莱顿大学医学中心的研究团队在《Heliyon》上发表了创新性研究，他们将冷冻保存的hiPSC来源肾脏祖细胞与先进的基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)技术相结合，建立了一套全新的类器官质量评估体系。研究人员设计了一个精巧的实验方案：首先将hiPSC分化为第7天的肾脏祖细胞，这部分细胞相当于肾脏发育的"萌芽阶段"；然后将这些祖细胞冷冻保存1-15周不等，模拟临床生物样本库的存储条件；最后解冻细胞并继续培养至成熟类器官阶段（第7+18天）。通过这种设计，他们能够系统评估冷冻保存对类器官质量的影响。

研究采用了几个关键的技术方法：使用符合药品生产质量管理规范(GMP)标准的无蛋白冷冻保存液确保临床转化可行性；通过5μm高空间分辨率MALDI-MSI技术对完整类器官切片进行脂质组学分析，每个像素点可检测m/z 80-1000范围内的数百种脂质分子；结合统一流形逼近和投影(UMAP)算法对脂质谱数据进行无监督聚类分析；并在质谱检测后对同一切片进行免疫荧光染色验证，实现多组学数据整合。实验包含3个独立分化批次，冷冻组(cKOR)和对照组(KOR)各10个和7个类器官。

3.1. 肾脏类器官在祖细胞阶段冷冻保存后仍保持分化能力

研究发现，冷冻保存的肾脏祖细胞解冻后存活率超过94%，与未冷冻的对照组相当，表明冷冻过程对细胞活性影响极小。形成的类器官在明亮视野显微镜下显示出典型的肾脏形态特征，包含清晰的管状结构和球状团块。免疫荧光分析进一步证实，无论是冷冻组还是对照组，类器官都表达了完整的肾单位标记物：podocalyxin（肾小球标志）、cubilin（近端小管标志）和E-cadherin（远端小管标志）。更重要的是，研究人员还观察到了更精细的肾脏结构，如髓袢（SLC12A1阳性）和活跃增殖细胞（Ki-67阳性），证明冷冻后的类器官保持了正常的发育潜能。

3.2. KOR和cKOR的分子和脂质异质性通过空间脂质组学表征

研究最创新的部分在于应用高空间分辨率MALDI-MSI技术（像素大小5×5μm²）对类器官进行深入表征。UMAP分析基于脂质谱特征将类器官细胞分为10个不同的群体，这些群体通过质谱后免疫荧光染色被准确定位：包括足细胞（podocyte）、近端小管（proximal tubule）、远端小管（distal tubule 1和2）、发育中小管（developing tubule）、上皮混合群（epithelial mixture）以及4个基质细胞群（stromal 1-4）。特别值得注意的是，在E-cadherin阳性的远端小管区域内，脂质谱分析能够区分出两个不同的亚群，这可能代表了不同成熟阶段的远端小管细胞。而那些与近端小管（LTL阳性）和肾小球（nephrin阳性）标记物都有重叠的区域，被定义为上皮混合群，反映了类器官中细胞分化的复杂性。

3.3. MALDI-MSI可作为iPSC肾脏类器官表型表征工具

研究人员提出了一套类器官质量评估标准：首先，冷冻后祖细胞存活率应超过90%；其次，需要确认肾脏细胞群体的存在和空间分布。通过比较KOR和cKOR中各细胞群体的比例，发现除了cKOR中近端小管比例略高外，其他细胞群体的分布高度一致。这表明冷冻保存基本保持了类器官的细胞组成完整性，MALDI-MSI能够敏感地检测出细微的组成差异。

这项研究的结论部分强调，MALDI-MSI技术为复杂组织工程产品的质量评估提供了全新视角。与传统免疫荧光分析相比，这种无标记技术能够在单细胞水平上同时检测数百种脂质分子，且不需要预先选择特定标记物，从而提供更全面的组织组成信息。特别是对于hiPSC分化的类器官这种含有多种细胞类型的复杂组织，MALDI-MSI能够识别出那些容易被常规方法忽略的细微差异，如不同成熟阶段的细胞亚群。

研究的创新性在于将冷冻保存技术与先进的空间脂质组学分析相结合，为干细胞衍生组织的临床转化建立了新的质控标准。这不仅适用于肾脏类器官，也可推广到其他类型的器官组织工程领域。随着再生医学的不断发展，这种高效、全面的质量评估方法将加速类器官技术从实验室向临床应用的转化，为未来个性化医疗和器官替代治疗奠定坚实基础。