血清分型非哺乳动物AAV实现完全中和抗体逃逸 为基因治疗再给药提供新策略

《Cell Reports Medicine》：Complete neutralizing antibody evasion by serodivergent non-mammalian AAVs enables gene therapy redosing

本研究针对AAV基因治疗中预存免疫和再给药难题，开发了源自番鸭的血清分型AAV.div3A载体。该载体可完全逃逸中和抗体，在庞贝病模型中成功实现再给药并显著提升GAA酶水平。其工程化变体AAV.div3A-M1更具肌向性，为免疫逃逸基因治疗提供了新平台。

　　

在基因治疗领域，腺相关病毒(AAV)因其安全性好和长期表达的特点，已成为最常用的基因递送载体。目前已有六种AAV基因疗法获得FDA批准，用于治疗莱伯先天性黑蒙、脊髓性肌萎缩症等疾病。然而，AAV基因治疗面临着一个巨大挑战：预存免疫。由于30%-80%的成人体内存在针对天然AAV的中和抗体(NAb)，这些抗体能够识别并清除治疗用AAV载体，导致治疗效果大打折扣甚至完全失效。更棘手的是，患者在接受首次AAV基因治疗后，自身也会产生高滴度的中和抗体，这使得后续的再给药几乎不可能实现。

预存免疫问题严重限制了患者获得基因治疗的机会。据统计，45%的AAV临床试验将血清阳性的患者排除在外，而对于血液疾病，这一比例甚至超过90%。目前解决这一问题的策略包括使用免疫抑制剂，但这些药物会带来显著的副作用，且不能完全消除免疫介导的毒性风险。近年来，已有数例患者因免疫相关毒性不幸死亡的报道，凸显了开发新策略的紧迫性。

面对这一挑战，杜克大学Aravind Asokan教授团队另辟蹊径，将目光投向了自然界中丰富的AAV多样性。AAV属于依赖病毒属(Dependoparvovirus)，是一个感染多种鸟类、哺乳动物和爬行动物的多样化病毒类群。尽管自然界存在如此丰富的AAV资源，但目前进入临床试验的AAV载体绝大多数来源于人类或非人灵长类动物。研究人员推测，那些来源于非哺乳动物（特别是鸟类）的AAV毒株，由于其衣壳蛋白与灵长类来源的AAV存在显著差异，可能不会被人体内的预存抗体所识别，从而实现"免疫逃逸"。

基于这一思路，Loeb等人近期发现，将非哺乳动物AAV衣壳蛋白的N端结构域替换为灵长类AAV的对应区域，可以显著提高这些病毒在人类细胞中的转导效率。在本研究中，团队将这一发现应用于工程化免疫逃逸型AAV衣壳，为基因治疗再给药提供了创新性解决方案。

研究人员首先建立了一个系统的方法来筛选具有免疫逃逸潜力的AAV衣壳。他们从435种依赖病毒属病毒中，通过主成分分析和K-means聚类，筛选出了16个与灵长类AAV亲缘关系较远的候选病毒。然后，他们采用矩阵策略，将每个候选衣壳与四种不同的灵长类AAV N端结构域进行组合，最终构建了一个包含80种嵌合衣壳的AAV.div文库。为了高效评估这些衣壳的性能，研究团队为每种衣壳设计了独特的条形码，使其能够在混合体系中同时进行体内外筛选。

研究的关键技术方法包括：条形码衣壳文库筛选技术（通过下一代测序分析各衣壳在组织和细胞中的富集情况）、理性衣壳工程（通过肽段插入改造衣壳组织趋向性）、体外中和抗体检测（评估血清样本对AAV转导的抑制效果）、以及庞贝病小鼠模型中的再给药实验（评估治疗基因GAA的表达水平）。人血清样本来自20名捐赠者，非人灵长类动物血清来自预存免疫模型。

AAV.div3A的鉴定与表征

文库筛选结果显示，源自番鸭AAV的嵌合衣壳AAV.div3A表现最为出色。该衣壳在心脏、骨骼肌和肝脏等多种组织中均显示出强大的转导能力。值得注意的是，AAV.div3A与常用的灵长类AAV（如AAV8、AAV9等）在血清学上完全正交，即针对这些常见AAV的抗体无法中和AAV.div3A。

结构分析揭示了AAV.div3A免疫逃逸的分子基础。与AAV9相比，AAV.div3A衣壳表面可变区(VR)存在显著差异，尤其是在形成3倍对称轴的区域。这些表面结构的改变可能影响了抗体识别表位的暴露，从而使其能够逃逸预存抗体的识别。

AAV.div3A的免疫逃逸能力

研究人员通过一系列实验证实了AAV.div3A出色的免疫逃逸能力。在体外实验中，即使用高滴度的抗AAV9血清处理，AAV.div3A的转导效率也几乎不受影响，而AAV9则被完全中和。更重要的是，在20名人类捐赠者的血清筛查中，虽然6名捐赠者对AAV9呈血清阳性，但所有捐赠者对AAV.div3A均呈血清阴性。

体内实验进一步验证了这些发现。在被动免疫实验中，预先注射了抗AAV9血清的小鼠，在接受AAV9治疗后几乎检测不到转导信号，而AAV.div3A的转导效率则完全不受影响。在模拟临床再给药场景的载体诱导免疫实验中，预先接受过AAV9治疗的小鼠，再次给予AAV9时几乎观察不到治疗效应，而使用AAV.div3A进行再给药则能够显著提高治疗基因的表达水平。

理性工程化优化组织趋向性

考虑到许多遗传性肌肉疾病（如杜兴氏肌营养不良、庞贝病等）的治疗需求，研究人员进一步对AAV.div3A进行工程化改造，希望增强其肌肉组织趋向性。他们在衣壳的VR8区域插入了不同的RGD肽段，这些肽段已知能够促进整合素结合，从而增强肌肉特异性。

筛选发现，携带特定RGD肽段的变体AAV.div3A-M1在心脏和膈肌中的转导效率分别比亲本AAV.div3A提高了14倍和12倍，同时肝脏中的转导显著降低（减少93%）。这种肌向性特征使得AAV.div3A-M1特别适用于肌肉相关疾病的治疗。

庞贝病模型中的治疗验证

为验证AAV.div3A平台的临床应用潜力，研究团队在庞贝病小鼠模型中进行了再给药实验。庞贝病是一种由于酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)缺乏引起的遗传性代谢疾病，早期发病的特点使得儿童患者在接受AAV基因治疗后，可能因生长导致的载体稀释或转基因沉默而需要再次给药。

实验结果显示，首次接受AAV9治疗的小鼠，在第二次给予AAV9时几乎检测不到GAA酶活性。相反，使用AAV.div3A或AAV.div3A-M1进行再给药的小鼠，在膈肌和心脏组织中的GAA酶水平显著提高。特别是AAV.div3A-M1，使膈肌中的GAA活性提高了9倍，心脏中提高了7倍，展现了优异的再给药效果。

本研究通过利用自然界中丰富的AAV多样性，成功开发了一种能够完全逃逸预存免疫和载体诱导免疫的基因治疗平台。AAV.div3A及其工程化变体不仅能够绕过患者体内已有的中和抗体，使得更多患者有资格接受基因治疗，还为实现安全有效的再给药提供了可能。

值得注意的是，AAV.div3A的免疫逃逸特性源于其与灵长类AAV的进化距离，而非通过点突变等传统方法。这种"血清分型"策略可能比表面残基突变更为有效，因为后者通常只能逃逸低滴度的单克隆抗体或抗血清，而难以应对动物模型和患者中观察到的高滴度多克隆抗体反应。

此外，研究还发现AAV.div3A不依赖于典型的AAV受体(AAVR)进行细胞转导，这是除AAV4类病毒外，首个被证实具有AAVR非依赖性的天然分离株。这一特性为其独特的生物学行为提供了部分解释，但其具体的细胞进入机制仍有待进一步研究。

尽管AAV.div3A在免疫逃逸方面表现出色，但研究人员也指出了研究的局限性。与其它AAV载体一样，AAV.div3A本身也会激发机体产生新的抗体反应，因此不能用于同一衣壳的重复给药。然而，它特别适用于存在预存免疫的患者，或者初次治疗效果不佳需要再次给药的情况。

总的来说，这项研究展示了如何通过利用病毒的自然多样性来解决基因治疗中的关键瓶颈问题。AAV.div平台不仅有望扩大适合接受基因治疗的患者人群，还为需要多次给药的疾病提供了新的治疗策略。随着进一步的大型动物实验和临床前研究的开展，这种基于血清分型AAV的免疫逃逸策略有望在未来为更多遗传性疾病患者带来希望。

该研究成果发表于《Cell Reports Medicine》期刊，为基因治疗领域克服免疫障碍提供了创新性的解决方案，标志着我们在实现安全有效的基因治疗再给药方面迈出了重要一步。