靶向SHP-1的免疫治疗多肽LeishPepThera(PepA)通过调控NFAT5/IL-10/IL-12轴促进皮肤利什曼病寄生虫清除

《iScience》：Evaluating LeishPepThera (PepA) as an immuno-therapeutic for Leishmania major infection

本研究针对皮肤利什曼病治疗中细胞因子失衡导致的寄生虫持续感染难题，开发了人工智能设计的免疫治疗多肽LeishPepThera(PepA)。研究人员通过分子对接、分子动力学模拟和体外体内实验验证，发现PepA能特异性抑制SHP-1磷酸酶活性，促进NFAT5核转位，上调IL-12和Nos2表达，同时抑制IL-10，诱导M1型巨噬细胞极化，显著降低寄生虫负荷。该研究为宿主导向的免疫治疗提供了新策略，具有重要转化价值。

　　

在热带与亚热带地区，一种由利什曼原虫引起的传染病——皮肤利什曼病，正困扰着数百万患者。这种疾病不仅导致皮肤溃疡、瘢痕形成，还可能引发严重的社会歧视和心理负担。更令人担忧的是，现有治疗方案如五价锑制剂、米替福新等存在明显局限性：价格昂贵、毒副作用大、耐药性日益严重。即便使用两性霉素B这类高效药物，复发案例也时有报道。面对这一困境，科学家们将目光转向了免疫治疗——通过调节宿主免疫系统来对抗寄生虫的新策略。

在利什曼原虫与宿主的复杂博弈中，细胞因子的动态平衡尤为关键。特别是IL-12和IL-10这一对"冤家"，它们分别主导着Th1型免疫反应（促进寄生虫清除）和Th2型反应（导致寄生虫持续存在）。而在这背后，一个名为SHP-1的蛋白酪氨酸磷酸酶扮演着"调节器"的角色。当利什曼原虫感染宿主后，其分泌的GP63蛋白能激活SHP-1，进而抑制转录因子NFAT5的核转位。NFAT5本是促进IL-12表达和一氧化氮产生的关键因子，一旦被"困"在胞浆中，宿主清除寄生虫的能力就会大打折扣。

面对这一机制，印度国家细胞科学中心的Shweta Khandibharad和Shialza Singh博士团队独辟蹊径，采用人工智能与机器学习算法，针对SHP-1的催化基序设计了一系列治疗性多肽。经过严格的筛选，他们最终获得了三个候选多肽：PepA、PepB和PepC，其中PepA（后被命名为LeishPepThera）表现最为出色。

研究人员首先通过高效液相色谱和电喷雾电离质谱确认了多肽的高纯度（>98%）和正确分子量。随后在体外实验中，他们发现125μg/mL的PepA能显著降低腹腔巨噬细胞内的寄生虫负荷，同时诱导产生21μM的亚硝酸盐（一氧化氮的指标），表明其具有较强的寄生虫清除能力。更重要的是，PepA对巨噬细胞的选择性指数大于1，说明其对寄生虫的抑制效果优于对宿主细胞的毒性。

在动物模型研究中，研究人员在BALB/c小鼠耳廓建立皮肤利什曼病病变，当病变直径达到3mm时，局部注射多肽进行治疗。结果显示，PepA治疗组小鼠的病变大小显著减小至约1mm，而感染未治疗组和PepC治疗组的病变大小仍维持在3mm以上。尤为重要的是，PepA治疗还减轻了感染导致的脾脏肿大，这一现象在利什曼病中常与疾病严重程度相关。

为深入探究机制，研究人员检测了关键信号分子的变化。激光扫描共聚焦显微镜显示，PepA治疗组巨噬细胞中NFAT5的核定位明显增加，而SHP-1的表达则降低。Western blot结果进一步证实，PepA能下调SHP-1及其磷酸化形式（P-564-SHP-1）的表达。通过链霉亲和素pull-down实验，研究人员直接证明了PepA与SHP-1之间的相互作用。计算生物学分析还揭示了SHP-1上与PepA结合的关键氨基酸残基，包括Thr374、Ser477、Ile480和Arg482。

免疫表型分析更是揭示了PepA的独特作用。流式细胞术显示，PepA治疗组病变组织中CD80⁺ M1型巨噬细胞比例高达12%，而CD163⁺ M2型巨噬细胞仅占4%，表明PepA能促进巨噬细胞向抗菌表型极化。在淋巴结中，PepA治疗组Nos2 mRNA表达上调了16.8倍，同时寄生虫数量显著减少。血清细胞因子检测发现，PepA治疗组IL-12水平高达1,144.5 pg/mL，而IL-10水平降至244.6 pg/mL，成功逆转了感染导致的细胞因子失衡。

本研究综合运用了多肽合成与表征、寄生虫负荷测定、一氧化氮检测、巨噬细胞毒性评估、动物模型治疗、激光扫描共聚焦显微镜、Western blot、流式细胞术、实时定量PCR、酶联免疫吸附测定等技术方法，其中实验动物包括BALB/c小鼠、IL-10和IL-12基因敲除小鼠。

纯化与表征多肽

通过高效液相色谱和电喷雾电离质谱确认合成多肽的高纯度与正确分子量。PepA纯度达99.947%，分子量为1,678.2 Da，与理论值高度一致。多种电荷状态的存在证实了多肽的高质量合成与纯化。

多肽对寄生虫和腹腔巨噬细胞的细胞毒性研究

采用DAPI染色和激光扫描共聚焦显微镜定量分析寄生虫负荷。结果显示125μg/mL PepA能显著降低寄生虫数量而不影响巨噬细胞形态。Griess试剂法检测亚硝酸盐水平表明PepA诱导的一氧化氮产量最高（21μM）。 Annexin V/PI凋亡实验证实治疗浓度对巨噬细胞无显著毒性。

多肽对小鼠物理参数和器官的影响

监测小鼠体重、病变大小、淋巴结重量及脾脏肝脏大小。PepA治疗显著减小病变尺寸（从3mm降至1mm），减轻脾脏肿大，且不影响小鼠体重。

基因敲除小鼠的细胞因子谱分析

通过qRT-PCR分析IL-10KO和IL-12KO小鼠的细胞因子表达。IL-10KO中TNF-α、IFN-γ和Nos2表达上调，而IL-12KO中TGF-β和IL-4表达升高，证实IL-10/IL-12平衡对免疫极化的关键作用。

NFAT5和SHP-1的表达分析

激光扫描共聚焦显微镜与Western blot显示PepA促进NFAT5核转位并抑制SHP-1表达。Pull-down实验直接验证PepA与SHP-1的相互作用。丙氨酸扫描突变分析揭示SHP-1上关键结合残基。

肽治疗小鼠病变中巨噬细胞群的鉴定

流式细胞术分析病变组织免疫细胞组成。PepA治疗组CD80⁺ M1型巨噬细胞比例显著升高（12%），CD163⁺ M2型比例降低（4%），表明肽治疗促进抗菌免疫应答。

小鼠肽治疗的免疫反应研究

通过ELISA检测血清IL-10和IL-12水平，qRT-PCR分析淋巴结Nos2表达，极限稀释法测定寄生虫负荷。PepA恢复IL-12/IL-10平衡，增强Nos2表达，显著降低淋巴结寄生虫数量。

本研究通过系统性实验验证了人工智能设计的免疫治疗多肽PepA（LeishPepThera）在皮肤利什曼病治疗中的潜力。研究结果表明，PepA能特异性靶向宿主SHP-1蛋白，通过抑制其磷酸酶活性，促进NFAT5转录因子核转位，进而重塑IL-10/IL-12细胞因子平衡，诱导M1型巨噬细胞极化，增强一氧化氮介导的寄生虫清除能力。

值得注意的是，PepA不仅显著降低寄生虫负荷，还逆转了感染相关的脾脏肿大等病理特征，且对宿主细胞毒性较低，展现出良好的安全性特征。与现有治疗药物米替福新相比，PepA通过独特免疫调节机制发挥作用，为克服传统药物的局限性提供了新思路。

尽管研究存在一定局限，如缺乏PepA与SHP-1结合亲和力的直接测量，以及与一线药物的直接比较，但多层次证据均支持PepA作为宿主导向免疫治疗剂的潜力。作者提出的合成电路递送策略，有望进一步优化PepA的靶向性和持久性。

这项发表于《iScience》的研究不仅为皮肤利什曼病治疗提供了新候选药物，更展示了人工智能驱动药物设计的强大能力。通过精准靶向宿主-寄生虫相互作用的关键节点，LeishPepThera可能代表了一种新型免疫治疗范式，对未来抗感染药物开发具有重要启示意义。