基于微型Cas12f1的双链DNA碱基编辑系统开发及其在基因组编辑中的应用

《iScience》：Base editing both DNA strands in distinct editing windows with small CRISPR-associated effector Cas12f1

本刊推荐：针对传统CRISPR碱基编辑器尺寸过大、编辑窗口受限的问题，研究团队基于微型CRISPR-Cas12f1系统开发了新型腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE）。研究发现AsCas12f1碱基编辑器不仅能对非靶链进行高效编辑，还能在独特编辑窗口内实现靶链碱基转换，这一突破性发现为基因治疗提供了更紧凑、更灵活的编辑工具。该研究发表于《iScience》，为基因组编辑领域带来了新的技术突破。

　　

在基因组编辑技术飞速发展的今天，CRISPR-Cas系统已经成为生命科学领域最强大的基因操作工具。然而，传统的Cas9和Cas12a碱基编辑器存在一个致命缺陷——它们太大了。这些"分子剪刀"的庞大尺寸严重限制了其在基因治疗中的应用，特别是无法装入腺相关病毒（AAV）这种最常用的基因治疗递送载体中。此外，传统碱基编辑器通常只能编辑DNA双链中的一条链（非靶链），编辑窗口有限，这在一定程度上制约了其应用范围。

面对这些挑战，研究人员将目光投向了自然界中更精巧的基因编辑工具——CRISPR-Cas12f1系统。这种微型Cas蛋白仅有422个氨基酸，大小不到传统Cas9的三分之一，但其编辑能力却不容小觑。发表在《iScience》上的这项研究，正是利用这一微型系统开发出了新型碱基编辑器，并意外发现了其独特的双链编辑能力。

为了开展这项研究，团队主要运用了以下关键技术方法：首先通过蛋白质工程构建了dCas12f1与脱氨酶（TadA8e或APOBEC1）的融合蛋白；利用三质粒系统在大肠杆菌模型中评估编辑效率；采用深度测序技术对编辑结果进行精准定量分析；通过比较不同Cas12f1同源蛋白（AsCas12f1和Un1Cas12f1）的编辑特性揭示其机制差异。

AsCas12f1在质粒DNA上的靶链碱基编辑

研究人员设计了一套精巧的实验系统：pCas质粒编码催化失活的AsCas12f1（dCas12f1）与脱氨酶的融合蛋白，pTarget质粒包含目标序列，而pGuide质粒则表达相应的单链引导RNA（sgRNA）。通过在大肠杆菌中共同表达这些组件，团队发现了一个令人惊讶的现象——除了预期的非靶链编辑外，AsCas12f1碱基编辑器还能高效编辑靶链上的碱基。

这种靶链编辑主要发生在原间隔子（protospacer）的PAM远端区域，与传统认知形成了鲜明对比。通常认为，靶链由于与sgRNA形成异源双链结构，其碱基应该不易被脱氨酶接触。然而，AsCas12f1似乎能够以某种方式使靶链碱基暴露于脱氨酶的作用范围内。

基因组靶点的AsCas12f1碱基编辑

当研究从质粒靶点转向基因组靶点时，团队观察到编辑窗口变窄，但编辑模式与质粒靶点基本一致。有趣的是，腺嘌呤碱基编辑器（ABE）在基因组位点上仍能同时编辑靶链和非靶链，而胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的编辑则仅限于非靶链。这种差异提示基因组环境中的DNA拓扑结构、可及性等因素可能影响脱氨酶的接近能力。

Un1Cas12f1 ABE和CBE的比较研究

为了探究双链编辑是否是AsCas12f1独有的特性，团队还构建了基于Un1Cas12f1的碱基编辑器。结果显示，Un1Cas12f1 CBE仅能编辑非靶链，且效率较低，而Un1Cas12f1 ABE在所测试的位点上完全没有编辑活性。这一发现表明，不同Cas12f1同源蛋白在编辑特性上存在显著差异，可能与它们的蛋白结构特征有关。

讨论与展望

该研究最重要的发现是AsCas12f1碱基编辑器能够实现双链DNA编辑，这一特性可能源于其独特的二聚体结构和DNA解旋机制。研究人员推测，AsCas12f1可能引起了超出sgRNA-靶链异源双链区域的DNA熔解，从而暴露了更多碱基作为脱氨酶的底物。

从应用角度看，Cas12f1碱基编辑器的小尺寸使其特别适合体内基因治疗应用。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE）的编码序列长度分别为2.3 Kbp和1.9 Kbp，完全符合AAV载体的包装容量限制。此外，更宽的编辑窗口和双链编辑能力为精准基因组编辑提供了新的可能性。

然而，该研究也存在一定局限性。所有实验均在原核生物大肠杆菌中进行，其染色质环境、DNA修复途径等与真核细胞存在显著差异。未来需要在真核细胞特别是哺乳动物细胞中进一步验证这些编辑器的性能。

这项研究不仅扩展了CRISPR-Cas工具箱，更重要的是挑战了我们对碱基编辑机制的传统认知。正如研究人员在讨论中指出的，自然界中存在的CRISPR-Cas系统及其衍生的合成变体可能具有意想不到的独特特征，这些特征不仅具有基础研究价值，还可能为特定应用场景提供新的解决方案。随着对Cas12f1系统机制的深入理解，我们有理由期待这一微型基因编辑工具将在生物技术和医学领域发挥重要作用。