基于Luminex xMAP技术的糖结合物疫苗结合糖多重定量方法开发与应用

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：A multiplex method for high-throughput quantification of conjugated saccharide in glycoconjugate vaccines

本文介绍了一种基于Luminex xMAP技术的四重免疫分析法，可直接同步定量MenACWY疫苗中的结合糖含量。该方法避免了传统HPAEC-PAD法的复杂前处理步骤，在特异性、灵敏度和准确性方面表现优异，为多价糖结合物疫苗的高通量质控提供了新方案。

　　

在疫苗研发领域，糖结合物疫苗因其能够有效诱导婴幼儿免疫应答而成为防控脑膜炎等传染病的关键工具。然而，随着多价疫苗的发展，传统理化分析方法面临严峻挑战。目前主流的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法（HPAEC-PAD）需要复杂的水解、固相萃取等前处理步骤，特别是在MenW和MenY等具有相似糖重复单元的血清型分析中存在峰重叠问题。更棘手的是，传统方法需分别测定总糖和游离糖含量，通过间接计算获得结合糖（CS）数据，过程耗时耗材且准确度受限。

为解决这一行业痛点，意大利帕维亚大学与葛兰素史克联合研究团队在《Analytical and Bioanalytical Chemistry》发表创新性研究，开发了基于Luminex xMAP技术的四重免疫分析法。该方法采用独特的夹心法配置：通过血清型特异性单克隆抗体修饰的磁珠捕获目标抗原，再应用抗CRM₁₉₇多克隆抗体进行检测，实现了MenACWY疫苗中四种结合糖的直接同步定量。

关键技术方法包括：1）优化抗体偶联条件确定最佳mAb用量（MenA 4.0μg/百万磁珠、MenC 1.0μg/百万磁珠等）；2）建立四重检测体系替代三加一模式，实现单孔内四种抗原同步分析；3）采用蛋白G柱纯化抗CRM₁₉₇抗体降低背景信号；4）通过平行线分析（PLA）统计模型进行数据验证。

方法开发

研究团队通过系统优化确立了关键实验参数。在磁珠偶联环节，发现不同血清型需要特异性的抗体用量才能获得最佳信噪比。特别值得注意的是，使用Fc特异性二抗可显著降低非特异性结合，而抗CRM₁₉₇血清的纯化处理则大幅改善了线性范围和检测限。针对MenA浓度高于其他血清型的特点，团队通过调整起始稀释度和滴定步骤，成功建立了适用于所有四种抗原的统一检测条件。

特异性

针对MenW和MenY糖结构高度相似可能引发的交叉反应风险，研究设计了巧妙的验证实验。通过制备缺失单一抗原的配方进行测试，结果显示回收率均在82%-120%范围内，证实了方法的血清型特异性。更令人印象深刻的是，即使加入相当于疫苗中实际含量的游离寡糖（OS）或100μg/mL游离CRM₁₉₇蛋白，结合糖的定量结果也未受影响，凸显了方法对疫苗活性成分的特异性识别能力。

方法性能

在50%-150%浓度范围内的可行性研究中，该方法展现出优异的分析性能。除MenY在低浓度水平外，其余准确度均控制在±20%范围内。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别达到pg/mL级别，MenA的LOD低至2.0 pg/mL。批间精密度CV%普遍低于20%，批内精密度更是达到6%-9%的高水平。线性回归分析显示所有血清型的R²≥0.99，斜率接近1，表明方法具有良好的定量能力。

稳定性监测

通过三种不同的稳定性实验验证了方法的指示能力。在温和酸水解条件下（0.5 mM TFA，30°C），方法成功监测到MenA因磷酸二酯键更易水解而呈现的快速降解趋势。在55°C加速稳定性实验中，虽然与HPAEC-PAD结果在后期时间点出现偏差，但研究团队敏锐地发现这源于温度超过CRM₁₉₇的转变中点温度（T_m 46.3°C）导致的蛋白构象变化。随后在25°C长期稳定性实验中，两种方法结果高度一致，证实了Luminex方法在实际稳定性监测中的可靠性。

研究结论表明，这种多重免疫分析法成功克服了传统理化方法的局限性，实现了无需前处理的直接定量，显著提高了检测通量。特别值得关注的是，该方法通过针对糖抗原和载体蛋白的双特异性识别，有效区分了结合糖与游离成分，为疫苗质量控制提供了更直接、准确的解决方案。虽然方法目前针对CRM₁₉₇载体开发，但研究者指出通过更换抗破伤风类毒素（TT）或抗白喉类毒素（DT）抗体，可轻松适配不同载体蛋白的疫苗平台。

这项技术的成功开发标志着糖结合物疫苗分析进入了新时代，为应对日益复杂的多价疫苗挑战提供了强有力的工具。其高通量、多指标同步检测的特点尤其适合现代疫苗生产的质量控制需求，有望成为下一代疫苗分析的标准方法之一。随着疫苗价数的不断增加，这种基于Luminex技术的分析方法展现出广阔的应用前景，将为全球疫苗质量保障提供重要技术支持。