新皮质深层Oprk1阳性神经元与屏状核神经元在连接和活动上的相似性：一种平行互补的皮质微电路

《iScience》：Similarities of neocortical deep layer Oprk1-positive neurons and claustrum neurons in connectivity and activity

本研究针对屏状核（CLA）功能及其与皮质深层屏状核样皮质神经元（CLC）的关系尚不明确的问题，开展了关于Oprk1阳性CLC神经元连接组和功能特性的系统性研究。通过病毒追踪、c-Fos标记和光纤光度记录等技术，研究人员发现CLC神经元主要与感觉皮质互连，其投射模式与主要投射至中线边缘皮质的CLA神经元形成互补；两者均在新奇环境中被激活并在麻醉下呈现同步化活动。结果表明CLC神经元构成了一个与屏状核平行且互补的皮质微电路，为理解大脑同步化状态调控提供了新见解。

　　

大脑中有一个神秘而古老的结构叫做屏状核（Claustrum, CLA），它隐藏在皮质之下，与大脑皮层有着极其广泛的连接。自从弗朗西斯·克里克（Francis Crick）提出屏状核可能与意识相关以来，这个结构就引起了神经科学家的极大兴趣。研究表明，屏状核在睡眠、麻醉、癫痫等同步化大脑状态中扮演着重要角色，但其精确功能仍是一个谜。

令人惊讶的是，科学家们发现屏状核的特异性基因标记物，如κ-阿片受体（Oprk1）和核受体Nurr1（Nr4a2），并非仅存在于屏状核内。在远离屏状核的新皮质深层，特别是在感觉皮层区域，也散布着一群表达这些基因的神经元。这些神经元在转录组水平上与屏状核神经元高度相似，因此被称为屏状核样皮质神经元（Claustrum-like cortical neurons, CLC）。然而，与研究相对较多的屏状核相比，我们对这些CLC神经元的连接模式和功能特性知之甚少。它们是与屏状核功能相似的“分散屏状核”，还是扮演着完全不同的角色？它们与屏状核是协同工作还是各自为政？这些问题构成了本研究探索的起点。

为了解决这些问题，来自中国科学院深圳先进技术研究院的研究团队在《iScience》上发表了他们的最新研究成果。他们系统性地比较了屏状核神经元与CLC神经元在全脑范围内的连接模式和功能特性，揭示了这两种转录组相似的神经元如何在大脑网络中构建平行且互补的微电路。

研究人员主要运用了几项关键技术来开展这项研究。他们首先构建并验证了一种Oprk1-cre转基因大鼠模型，能够特异性靶向表达Oprk1的屏状核和CLC神经元。利用这种模型，他们结合了逆向病毒追踪（AAV-Retro-DIO）、顺向病毒追踪（AAV-DIO）和跨单突触狂犬病病毒（RV）追踪技术，精细绘制了CLC神经元的输入输出连接图谱。通过免疫荧光染色和原位杂交技术，他们分析了神经元的活动标志物c-Fos表达。此外，他们还采用多通道光纤光度记录技术，同步记录了屏状核和CLC神经元在不同麻醉深度下的群体钙活动动态。

Claustrum and claustrum-like cortical neurons share a highly similar transcriptomic profile

研究首先确认了屏状核与CLC神经元在转录组上的高度相似性。位于大脑前部皮质下的屏状核复合体包括背侧屏状核（dCL）、腹侧屏状核（vCL）和背侧内嗅核（DEn）。而在缺乏典型屏状核结构的后部皮质中，深层神经元却表达着与屏状核相同的标记基因，如Oprk1和Latexin（Lxn）。来自艾伦脑科学研究所的单细胞测序数据进一步表明，屏状核的主要谷氨酸能神经元类型——CLA-Epd-CTX Car3神经元，同样广泛分布在大脑皮质的侧部区域。这些证据共同表明，屏状核与CLC神经元共享高度相似的转录组特征，可能起源于共同的发育谱系。

Retrosplenial cortex-projecting claustrum-like cortical and claustrum neurons express Nurr1 and Oprk1

为了探究CLC神经元是否与屏状核共享相似的连接模式，研究人员首先关注了屏状核的一个重要投射靶区——压后皮质（Retrosplenial Cortex, RSP）。通过将逆行示踪剂Fluoro-Gold（FG）注射到RSP，他们不仅如预期地在腹侧屏状核（vCL）发现了大量FG标记的神经元，还在后部皮质的感觉皮层（如S1、S2、V2）的深层发现了投射神经元。更为关键的是，通过荧光原位杂交（FISH）技术，他们证实这些投射到RSP的后部皮质神经元同样表达屏状核的标志基因Nurr1和Oprk1。定量分析显示，在vCL和皮质深层，有相当大比例的FG标记神经元共表达Nurr1和Oprk1，且两者之间没有显著差异。这一发现首次从连接组学角度证明，CLC神经元与屏状核神经元一样，参与了对特定高级皮质区域（如RSP）的投射。

Characterization of cre expression in Oprk1-cre rats

为了能够特异性操控和标记CLC神经元，研究人员构建了Oprk1-cre转基因大鼠品系。通过将其与Rosa26-tdTomato报告大鼠杂交，他们详细表征了cre表达的特异性。结果表明，Oprk1-cre介导的重组准确反映了内源性Oprk1的表达模式：不仅在屏状核复合体（dCL、vCL、DEn）中表达，也在散布于后部皮质的CLC神经元中表达，同时在嗅结节、丘脑背内侧核（MD）和基底外侧杏仁核（BLA）等已知表达Oprk1的脑区也有表达。这为后续使用cre依赖性病毒进行细胞类型特异性研究奠定了基础。

Retrograde tracing in Oprk1-cre rats shows that Oprk1+ claustrum-like cortical neurons project to retrosplenial cortex, prelimbic cortex, and medial entorhinal cortex

利用Oprk1-cre大鼠和cre依赖性逆向病毒（AAV-Retro-DIO），研究人员系统性地探索了CLC神经元的轴突投射靶区。他们将病毒分别注射到已知的屏状核主要靶区：压后皮质（RSP）、前边缘皮质（Prelimbic Cortex, PL）和内嗅皮质内侧区（Medial Entorhinal Cortex, MEC）。结果发现，Oprk1+ CLC神经元确实投射到所有这些区域。从RSP逆向标记的CLC神经元主要位于初级体感皮层（S1）；从PL标记的神经元主要位于外嗅皮质（Ect）；而从MEC标记的神经元也主要位于Ect，同时在V1、V2和颞叶联络区（TeA）也有分布。这表明CLC神经元能够投射到多个对认知功能至关重要的高级皮质区域。

Topography of claustrum-like cortical neurons projecting to prelimbic cortex, retrosplenial cortex, and medial entorhinal cortex

通过双色逆向病毒追踪技术（同时注射AAV-Retro-DIO-EGFP到RSP和AAV-Retro-DIO-tdTomato到PL或MEC），研究人员进一步揭示了投射神经元分布的地形图组织规律。在屏状核内，投射到RSP的神经元（vCL^RSP）位于vCL的“核心”区，而被投射到PL（vCL^PL）和MEC（vCL^MEC）的神经元则像“外壳”一样包围着核心区，且更偏向腹侧。类似地，在后部皮质，投射到RSP的CLC神经元（CLC^RSP）位于更背侧的感觉皮层（如S1），而投射到PL（CLC^PL）和MEC（CLC^MEC）的神经元则位于更腹侧的皮质区域（如Ect）。这种相似的地形分布规律暗示屏状核和CLC神经元可能遵循着共同的连接组织原则。

Efferents of Oprk1+ claustrum-like cortical neurons mainly target the cortex

接下来，研究人员使用顺向病毒追踪（AAV-DIO-EGFP）来直接观察CLC神经元的轴突末梢分布，即它们的“输出”网络。将病毒注射到听觉皮层（Au1）的CLC神经元后，他们发现CLC神经元的轴突广泛投射到多个皮质区域，但信号最强的是颞叶皮层（如Au1、Au2、TeA、Ect）和顶叶联络皮层（PtA）。定量分析表明，CLC神经元89%的投射靶向后部皮质，仅有11%靶向前部皮质；94%的投射位于新皮质，只有6%位于皮质下结构。为了直接比较，他们在同一只动物脑中分别用不同颜色的病毒标记了屏状核神经元（AAV-DIO-Ruby）和CLC神经元（AAV-DIO-EGFP）的投射。结果清晰地显示，屏状核神经元主要投射到中线皮质（如RSP）和边缘皮质（如岛叶皮质Ins、鼻周皮质PRh），而CLC神经元则主要投射到体感和听觉皮层。两者的投射模式形成了鲜明的互补分布。

Deep layer extracortical projection neurons and Oprk1+ claustrum-like cortical neurons have different projection patterns

为了确认CLC神经元的连接特性是否区别于其他类型的皮质深层兴奋性神经元，研究人员进行了一项对比实验。他们将标记一般兴奋性神经元的病毒（AAV-CamkIIα-mCherry）与标记CLC神经元的病毒（AAV-DIO-EGFP）共同注射到Au1的深层。结果发现，CamkIIα标记的神经元形态典型，树突伸向皮质表面，主要位于第V/VI层，并主要投射到皮质下结构（如内侧膝状体MG），在皮质内几乎没有轴突分支。而CLC神经元主要位于第VI层，其轴突广泛投射到同侧皮质（如内侧顶叶联络皮层MPtA）的第IV和第VI层，但在丘脑中没有信号。这证明CLC神经元是主要进行皮质内联络的神经元，其连接模式与主要进行皮质下投射的深层锥体神经元截然不同。

Neurons providing inputs to Oprk1+ claustrum-like cortical neurons are located in the posterior cortical regions

了解了一个神经元的“输出”后，研究人员进一步利用跨单突触狂犬病病毒（RV）追踪技术来揭示CLC神经元的“输入”来源。他们将辅助病毒（FLEX-TVA-mCherry）和伪狂犬病毒（RV-EnvA-ΔG-EGFP）注射到Au1的CLC神经元区域。结果显示，为CLC神经元提供直接输入的前突触神经元主要位于后部皮质，其中初级体感皮层（S1）贡献了最大的输入（约29%），其次是Au1本身（18%）和次级听觉皮层Au2（20%）。总体而言，83%的输入神经元位于后部皮质，84%位于新皮质。这表明CLC神经元主要接收来自同一感觉模态或邻近感觉皮质的输入，形成了一个局部互联的网络。

Claustrum and claustrum-like cortical neurons show strong novelty induced c-Fos staining and synchronised burst-like activity transients under anesthesia

最后，研究人员探索了屏状核和CLC神经元的功能特性。已知屏状核神经元在新奇环境中会被强烈激活。本研究通过 retro-DIO-tdTomato 标记投射到MEC的屏状核神经元（vCL^MEC）和CLC神经元（CLC^MEC），并检测它们在新奇环境（开放场地）下的c-Fos表达。结果发现，与居家对照组相比，暴露于新奇环境的动物，其vCL^MEC和CLC^MEC神经元中与c-Fos共标记的比例均显著升高。这表明两者都对新奇刺激有反应。

此外，屏状核已知在麻醉等同步化大脑状态中起作用。研究人员通过双通道光纤光度法，同时记录屏状核和CLC神经元在不同浓度异氟烷麻醉下的群体钙活动。他们发现，在较深麻醉（3%， 2%， 1.5% 异氟烷）时，两个脑区的钙信号都表现出同步的爆发式活动，且信号间具有很高的相关性（相关系数最高达0.86）。随着麻醉变浅（1%， 0%），这种同步性显著降低。这表明屏状核和CLC神经元在麻醉状态下会协同活动，可能共同参与了对大脑同步化状态的调控。

讨论与结论

本研究系统地描绘了屏状核样皮质神经元（CLC）的连接组和功能图谱，并与屏状核（CLA）神经元进行了深入的比较。研究结果表明，尽管屏状核和CLC神经元在转录组上高度相似，并且都主要与大脑皮层进行双向连接，但它们的“工作重点”区域是不同的。屏状核更像一个“中枢交换机”，广泛连接并可能整合来自前额叶、扣带回、压后皮质等高级联合皮层的信息，与意识、注意、睡眠等全局状态密切相关。而CLC神经元则更像分布式的“区域交换机”，主要嵌入在体感、听觉等感觉皮层内，与局部感觉信息的处理环路进行密切的交互。两者在连接模式上形成了清晰的互补关系。

在功能上，本研究提供了初步但有力的证据，表明屏状核和CLC神经元都参与了对新奇环境的反应，并且在麻醉状态下表现出高度同步的活动模式。这支持了“屏状核复合体”（包括经典的屏状核和散布的CLC神经元）作为一个整体，在调节大脑同步化状态（如睡眠、麻醉）和处理显著刺激（如新奇环境）中扮演重要角色的观点。

这项研究的意义在于，它将学术界的注意力从相对孤立的屏状核，引向了一个分布更广泛、可能功能更多样的“屏状核样”神经元系统。这些神经元虽然散布在皮质中，但可能与屏状核协同工作，共同构成一个调控大脑信息处理和状态转换的平行、互补网络。这为理解大脑如何协调局部感觉处理与全局认知状态提供了全新的框架。未来的研究需要进一步揭示CLC神经元在行为中的具体功能，例如它们在感觉处理、睡眠-觉醒周期转换乃至某些神经精神疾病（如抑郁症，已知Nurr1阳性神经元与人类抑郁症遗传风险相关）中的潜在作用。此外，这些神经元独特的发育起源和进化意义，也是值得深入探索的迷人问题。