毫秒级电镜技术揭示人与小鼠大脑皮层突触的超快内吞机制

《Neuron》：Ultrastructural membrane dynamics of mouse and human cortical synapses

本研究针对人类脑组织突触传递研究的技术瓶颈，开发了适用于急性脑切片的"电击-冷冻"时间分辨电镜技术，成功捕获了人与小鼠皮层突触囊泡循环的超微结构动态。研究发现两者均通过dynamin 1xA（Dyn1xA）介导的超快内吞作用实现毫秒级囊泡回收，揭示了该机制在物种间的保守性，为研究神经系统疾病的突触功能障碍提供了重要技术平台。

　　

人类大脑作为自然界最复杂的生物系统之一，其正常功能依赖于突触间精确的化学信号传递。突触囊泡的循环效率直接决定神经信号的传导质量，然而由于技术限制，科学家们对活体人脑组织中突触动态过程的认知长期停留在推测阶段。传统电镜虽能提供纳米级分辨率的结构信息，却只能呈现静态画面；而电生理记录虽能量化功能指标，却无法直观展示囊泡膜 trafficking 的时空动态。这种"结构-功能"鸿沟使得人类突触的运作机制始终蒙着神秘面纱。

为了突破这一技术瓶颈，约翰霍普金斯大学的Shigeki Watanabe团队在《Neuron》杂志发表了一项创新研究。他们巧妙地将电刺激技术与高压冷冻电镜结合，开发出适用于急性脑切片的"电击-冷冻"（zap-and-freeze）时间分辨电镜技术，首次在毫秒时间尺度上捕捉到人与小鼠皮层突触的膜动态过程。这项技术不仅为研究人脑突触功能提供了新范式，更揭示了超快内吞作用在人类大脑中的存在证据。

关键技术方法主要包括：1）构建兼容脑切片的电刺激装置（zap board），通过钙成像验证其刺激有效性；2）优化急性脑切片制备与NMDG保护性复苏方案，确保组织活性；3）建立毫秒级时间分辨的高压冷冻-电镜技术流程，实现突触动态事件捕捉；4）结合STED超分辨显微镜进行蛋白定位分析；5）使用癫痫手术切除的人脑组织（6例20-40岁患者）与小鼠脑组织进行对比研究。

The "zap board" induces calcium signaling in acute mouse brain slices

研究人员首先通过钙成像技术验证电刺激装置对脑切片的有效性。将小鼠小脑切片定向放置，使平行纤维与电场方向一致，施加1毫秒电脉冲后成功诱发分子层钙信号。当平行纤维与电场夹角超过45°时，钙信号显著减弱，证实了电场刺激的方向依赖性。皮层切片实验同样观察到刺激诱发的钙瞬变，尽管信号强度弱于小脑，表明该装置适用于不同脑区研究。

Visualizing synaptic vesicle endocytosis in acute mouse brain slices

在技术验证基础上，团队对刺激后的小鼠皮层切片进行时间分辨电镜分析。在刺激后100毫秒，活跃区边缘0-32纳米范围内出现大量无包被内陷结构，其直径约35-39纳米，颈宽58-72纳米。这些结构具有活动依赖性（TTX处理可抑制）和dynamin敏感性（dynasore处理可阻滞），符合超快内吞特征。STED显微镜观察发现内吞关键蛋白Dyn1xA预先聚集在活跃区外周，为超快内吞的分子机制提供证据。

Ultrafast endocytosis in human cortical synapses

研究最突破性的发现来自人脑组织实验。六例癫痫患者的手术切除组织分析显示，在相同时间点（100毫秒）出现类似内陷结构，距活跃区边缘5-31纳米，直径36-56纳米，颈宽67-108纳米，略大于小鼠对应结构。这些结构同样受TTX和dynasore调控，表明人脑皮层突触存在相同的活动依赖性内吞机制。值得注意的是，人脑内吞体尺寸（6,019-10,386 nm²）普遍大于小鼠（5,851-7,775 nm²），暗示物种间可能存在的膜 trafficking 尺度差异。

Dyn1xA clusters next to the active zone in mouse and human cortical synapses

分子机制研究表明，人与小鼠皮层兴奋性突触中Dyn1xA均主要定位于活跃区边界及外周区域（-50至+50纳米）。拓扑视角分析显示约47%（小鼠）和35-46%（人类）的Dyn1xA信号聚集于此区域，这种保守的预定位模式可能加速内吞速率，解释超快内吞的毫秒级动力学特征。

研究结论强调，"电击-冷冻"电镜技术成功搭建了连接突触结构与功能的桥梁，首次在原生人脑组织中可视化突触囊泡循环过程。超快内吞机制在人与小鼠大脑皮层的保守性，不仅验证了基础研究模型的可靠性，更为理解神经系统疾病（如阿尔茨海默病、多发性硬化等）的突触功能障碍提供新视角。该技术的优势在于无需外源蛋白表达即可激活神经元，保留组织天然细胞架构，未来可应用于病理状态下突触动态异常研究。尽管存在组织存活时间短（2-3分钟）、三维信息缺失等局限，但其毫秒-纳米级分辨率优势为揭示人脑突触奥秘开辟了新途径。

这项研究的意义超越技术层面，它证实了人类大脑采用与模式生物相似的突触囊泡回收策略，颠覆了人们对人脑突触特殊性的传统猜测。随着更多患者组织的应用，这种方法有望揭示神经精神疾病中特定的突触 trafficking 异常，为精准治疗提供新靶点。正如作者所言，"对人类组织的直接检查将继续为理解突触传递提供关键信息"，这项技术将推动神经科学从静态描述向动态解析的历史性转变。