GLYCO-BUILD：一种合成携带真核N-聚糖肽的酶促平台及其在生物医学中的应用

《Nature Communications》：GLYCO-BUILD: an enzymatic pipeline for the synthesis of peptides carrying eukaryotic N-glycans

本研究针对均一真核N-糖基化肽合成难题，开发了名为GLYCO-BUILD的全酶促合成平台。该技术通过筛选能够利用廉价植醇替代天然多萜醇的古菌/细菌/真核源酶组合，实现了从GlcNAc2到GlcNAc2Man9Glc3的真核N-聚糖模块化合成，并利用布氏锥虫单亚基寡糖转移酶（OST）实现高效糖基化。该平台为病毒糖抗原模拟、生物药代动力学优化提供了新策略。

　　

在生命科学和生物医学领域，蛋白质的糖基化修饰，特别是N-糖基化，是一种至关重要且普遍存在的翻译后修饰。绝大多数分泌蛋白和膜蛋白都带有N-聚糖，这些聚糖在蛋白质的正确折叠、质量控制、细胞内运输以及细胞间通讯中扮演着关键角色。在生物制药领域，聚糖的添加能够显著改善多肽或蛋白质药物的水溶性、循环半衰期和稳定性，同时减少聚集和降解。此外，许多病毒，如HIV、登革热病毒和丙型肝炎病毒，其表面蛋白也覆盖着密集的N-聚糖，这些聚糖不仅参与病毒感染过程，还能作为“糖盾”帮助病毒逃避免疫系统的识别。因此，能够合成携带特定、均一N-聚糖的糖肽或糖蛋白，对于基础研究、疫苗开发、诊断试剂以及创新生物疗法的发展具有巨大的应用潜力。

然而，生产结构明确的真核生物N-聚糖和N-糖肽一直面临严峻挑战。传统的方法各有局限：在真核细胞中过表达通常导致聚糖结构的异质性；细菌表达系统则因使用其自身的寡糖转移酶而效率低下，且难以正确折叠复杂的真核蛋白；固相肽合成法无法直接引入较大的聚糖；而化学酶法的转糖基反应则存在占位率低、所需氧唑啉供体底物化学合成困难等问题。特别是对于内质网中常见的寡甘露糖型和葡萄糖化聚糖，现有方法难以高效、高纯度地获得。这些瓶颈严重限制了均一糖缀合物的广泛应用。

为了解决这一难题，来自苏黎世联邦理工学院（ETH Zürich）的Lorenzo Rossi、J. Andrew N. Alexander、Ana S. Ramírez和Kaspar P. Locher等研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果，开发了一种名为GLYCO-BUILD的全酶促合成管道。该平台巧妙地绕过了现有技术的限制，能够以高均一性合成一系列真核生物N-聚糖，并将其高效地转移至多肽上。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，他们通过同源筛选和表达优化，获得了一系列能利用廉价植醇（Phytol）而非昂贵且难获取的多萜醇（Dolichol）作为脂质载体的重组酶，包括来自不同物种的糖基转移酶（如ALG家族酶）和单亚基寡糖转移酶（如布氏锥虫的TbSTT3A和TbSTT3B）。其次，他们建立了模块化的“一锅法”反应体系，通过组合不同的酶，逐步在植醇-焦磷酸-聚糖（LLO）上组装从核心二糖（GlcNAc₂）到复杂十四糖（GlcNAc₂Man₉Glc₃）的聚糖结构。最后，他们利用荧光标记、Tricine-SDS-PAGE、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术对合成的糖肽和糖蛋白进行了定性和定量分析，验证了聚糖结构的正确性和合成效率。

识别能够处理植醇作为脂质载体的酶

在真核生物中，内质网膜上的ALG酶依次催化，将保守的十四糖（GlcNAc₂Man₉Glc₃）组装在多萜醇焦磷酸酯上，然后转移至新生肽链。研究的关键突破在于发现并验证了一套酶组合（如来自 Streptococcus mutans 的UdpK、来自 Sulfolobus acidocaldarius 的SaAglH和SaAgl24，以及来自酵母、人类、鸡等多种生物的ALG酶），这些酶能够以廉价的植醇替代天然的多萜醇作为脂质载体，从而实现了植醇-焦磷酸-聚糖（Phy-PP-聚糖）的酶促合成。

模块化合成多种N-聚糖

研究人员将合成过程设计成多个模块化的“反应池”（Pot）：

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  Pot 1：成功合成了聚糖合成的核心起始物——植醇-焦磷酸-N, N'-二乙酰壳二糖（Phy-PP-GlcNAc₂），解决了该关键前体无法酶促合成的难题。
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  Pot 2a：利用胞质侧的甘露糖基转移酶（ScALG1, CeALG2, ScALG11），在Phy-PP-GlcNAc₂上依次添加甘露糖，合成了直至Phy-PP-GlcNAc₂Man₅（ER-Man5）的聚糖。
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  Pot 3a：利用内质网腔侧的甘露糖基转移酶（ScALG3, HsALG9, GgALG12）和酶促原位生成的植醇-磷酸-甘露糖（Phy-P-Man）供体，将ER-Man5进一步延伸至Phy-PP-GlcNAc₂Man₉，并可获得Man6, Man7, Man8等中间体。
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  Pot 3b：通过直接对Phy-PP-GlcNAc₂Man₃进行特定模式的甘露糖基化，合成了高尔基体-Man5（Golgi-Man5），这是合成复合型和杂合型N-聚糖的关键前体，并验证了其可被HsMGAT1进一步修饰。
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  Pot 4：利用葡萄糖基转移酶（ScALG6, HsALG8, ScALG10）和植烷醇-磷酸-葡萄糖（Phytanyl-P-Glc）供体，成功在Man9聚糖的A分支上添加了1到3个葡萄糖，合成了Glc1至Glc3的葡萄糖化聚糖。

TbSTT3A和TbSTT3B在体外表现出不同的LLO偏好性

研究人员测试了布氏锥虫（Trypanosoma brucei）的两种单亚基寡糖转移酶TbSTT3A和TbSTT3B转移植醇连接聚糖的效率。结果表明，TbSTT3A能有效转移Man3、Man5和Man9聚糖，对Man5偏好性最高；而TbSTT3B则高度特异性地高效转移Man9聚糖，对Man5的转移效率很低，对Man3则不转移。这为针对不同聚糖和目标肽段序列选择合适的OST提供了依据。

对含多个糖基化位点的多肽进行糖基化

研究证明，GLYCO-BUILD平台能够对含有三个紧密相邻糖基化位点的模型蛋白（荧光标记的硫氧还蛋白融合蛋白）进行高效糖基化。在过量LLO存在下，使用TbSTT3A和不同的植醇-聚糖，可以实现三个位点的完全（>95%）糖基化。TbSTT3B在转移Man9聚糖至含有其偏好序列的多肽时，也能实现多位点糖基化，尽管效率略低于TbSTT3A。

制备带有寡甘露糖聚糖的病毒糖肽

研究人员成功合成了模拟登革热病毒（NS1蛋白）、丙型肝炎病毒（E2包膜蛋白AS412抗原位点）和HIV（gp120 V3环）表面抗原的糖肽。通过调整OST（TbSTT3A或TbSTT3B）和聚糖类型（如Man5或Man9），能够以高均一性获得目标糖肽，这些糖肽在血清检测、疫苗研发等免疫学研究中具有应用潜力。例如，对于HIV V3迷你肽，通过优化糖基化位点序列，实现了双位点糖基化效率超过95%。

综上所述，GLYCO-BUILD研究建立了一个强大且灵活的酶促合成平台，成功克服了均一真核N-糖缀合物生产的重大瓶颈。其核心创新点在于利用廉价的植醇替代多萜醇，并通过广泛的酶同源物筛选和反应条件优化，实现了对真核生物内质网N-糖基化途径的体外精确重演。该平台具有高度的模块化和可扩展性，能够合成从简单核心结构到复杂寡甘露糖、葡萄糖化聚糖以及复合/杂合聚糖前体在内的多种均一N-聚糖，并利用高效的单亚基OST将其转移至多肽或蛋白质上。

这项研究的意义深远。首先，它为糖生物学基础研究提供了前所未有的均一糖缀合物工具，可用于研究糖基化酶的作用机制、糖蛋白的折叠与功能。其次，在生物医学应用方面，该平台能够生成携带精确聚糖的病毒抗原模拟物，用于血清学诊断、广谱中和抗体筛选以及新型疫苗设计。此外，通过为治疗性多肽或蛋白质安装特定的均一聚糖，可以精准调控其药代动力学性质，如半衰期、靶向性和免疫原性，从而优化生物药物的疗效和安全性。最后，该平台还能为糖芯片、质谱标准品制备以及细胞-free糖蛋白合成等领域提供关键的聚糖原料。总之，GLYCO-BUILD技术有望极大地推动糖科学及相关生物技术领域的发展，加速糖基化相关疾病的诊断和治疗策略的创新。