用于自由活动小鼠的高通量贝塞尔光束双光子三维脑成像技术

《Nature Communications》：High-throughput two-photon volumetric brain imaging in freely moving mice

本研究针对自由活动动物大规模神经活动三维成像的难题，开发了头戴式微型贝塞尔光束双光子显微镜(miniBB2p)，实现了420×420×80μm3范围内超过1000个神经元钙活动的同步记录，为神经环路功能研究提供了突破性工具。

　　

理解大脑如何工作，需要观察动物在自由活动时神经元的动态变化。然而，这面临着巨大的技术挑战。传统的双光子显微镜虽然能清晰观察神经元，但通常需要将动物的头部固定住，这极大地限制了其自然行为。近年来，头戴式微型显微镜的发展让在自由活动小鼠中观察大脑活动成为可能，但现有的技术，特别是基于高斯光束的微型双光子显微镜，在成像速度、三维空间分辨率以及对大脑微小运动的容忍度方面仍有局限。它们难以快速地对一个三维脑区体积进行高清成像，并且对动物活动引起的脑组织轴向移动非常敏感，容易导致图像模糊。

为了解决这些瓶颈，来自北京脑科学与类脑研究所、中国医学科学院基础医学研究所等机构的研究人员吴江来（Jianglai Wu）团队及其合作者，独辟蹊径地将“贝塞尔光束”（Bessel beam）这一先进光学技术应用于微型显微镜的设计中，成功开发出一种名为miniBB2p的头戴式微型贝塞尔光束双光子显微镜。这项研究成果已发表在《Nature Communications》上，为在自由活动的动物中实现大规模、高分辨率的三维神经活动监测打开了新的大门。

研究者们主要运用了几个关键技术方法：首先是基于贝塞尔光束对像散（astigmatism）敏感而对其他主要光学像差不敏感的特性，简化了显微镜物镜的光学设计，使用对称结构的扫描透镜和简化的物镜组合，实现了大视场（600μm）下的近衍射极限成像。其次，他们在大型模场面积光子晶体光纤（LMA-12）的末端定制了微型轴棱锥（微锥镜，apex angle=120°），用以产生用于三维成像的贝塞尔光束。再次，采用微机电系统（MEMS）镜进行激光扫描，并结合高灵敏度的硅光电倍增管（SiPM）直接探测荧光信号，提高了检测效率。研究利用C57BL/6J等品系小鼠，通过病毒载体（如rAAV2/9-CaMKIIa-jGCaMP7f）在特定脑区（如前扣带回皮层ACC、次级运动皮层M2）表达钙离子指示剂，并植入颅窗进行在体成像。行为学数据则通过DeepLabCut进行无标记点姿态分析。

Bessel beam简化了miniBB2p的光学设计

研究团队巧妙利用了贝塞尔光束的一个关键优势：在所有主要光学像差中，它主要对像散敏感，而对球差、彗差等相对不敏感。这使得研究人员可以采用一种系统性的设计方法，集中精力消除像散，同时允许其他像差控制在较低水平。具体来说，他们为扫描透镜和管透镜采用了对称设计（各由两个相同的平凸透镜组成），这最小化了彗差、畸变和倍率色差。而未校正的像散则由一个由两个平凸透镜组成的物镜进行完全补偿。最终，在0.3的低数值孔径（NA）下，整个光学系统在600微米的视场（FOV）内实现了接近衍射极限的性能。这种专注于校正像散的设计思路，显著减少了显微镜中的透镜数量，不仅降低了制造成本，也简化了组装和校准过程。

系统设计与性能测试

miniBB2p的头戴部分重量仅为2.6克，尺寸约为2.4 x 0.9 x 2.0 cm³，非常适合小鼠佩戴进行自由活动成像。系统使用1米长的大型模场面积光子晶体光纤传输920纳米飞秒激光脉冲，并通过光纤末端的定制微型轴棱锥产生贝塞尔光束。MEMS扫描镜使得最大方形视场达到420 x 420 μm²，成像帧率为每秒9帧（512 x 512像素）。性能测试显示，miniBB2p的横向分辨率（用500纳米荧光微球测量）在0.97-0.99μm之间，轴向分辨率在80-90μm之间。其横向分辨率相当于使用更高NA（0.35）的高斯光束所能达到的衍射极限分辨率。特别值得注意的是，其荧光收集效率比具有可比视场和横向分辨率的先进平台高出2-4倍。

miniBB2p与台式高斯光束双光子显微镜的成像对比

研究人员首先对表达GFP的（Thy1-GFP-M）小鼠脑切片进行成像。结果显示，使用商业台式高斯光束2PM（NA 0.3，轴向分辨率22.9μm）需要对一个80微米厚的体积采集至少4张图像（Z轴层扫），而miniBB2p仅用一张图像就捕获了相同体积内的所有结构信息，景深增加了四倍。此外，贝塞尔光束焦点更高的分辨率使得树突棘的观察更为清晰。在自由活动小鼠的实验中，miniBB2p成功解析了前扣带回皮层（ACC）中1015个神经元的钙活动动态。作为对比，使用台式2PM对头部固定小鼠的同一体积进行分层（顶层、中层、底层）成像，仅识别出534个神经元，数量约为miniBB2p的一半。此外，miniBB2p还能在轴向延伸的体积内对多个树突分支上的树突树和树突棘的钙瞬变进行成像。

miniBB2p可实现对动物行为约束极小的纵向记录

为了评估佩戴miniBB2p对动物行为的影响，研究人员比较了未佩戴任何设备的小鼠与佩戴了与miniBB2p同等重量、带有光纤和电缆的模拟显微镜的小鼠在行为学竞技场中的活动。结果表明，在总移动距离、平均及中位奔跑速度、进入中心区域的次数等方面，两组小鼠均无显著差异。这表明佩戴miniBB2p及相关线缆并未显著妨碍动物的自然行为。此外，通过连续多天成像同一视场，研究人员发现相同的神经元群体可以被持续监测数周，且光漂白和光损伤效应很小，证明了miniBB2p适用于慢性（长期）成像研究。

利用miniBB2p在不同行为范式下进行神经活动的高通量成像

研究人员利用miniBB2p在多种行为范式中记录了自由活动小鼠M2和ACC脑区神经元群体的高通量数据。首先，他们研究了M2锥体神经元对运动的反应。在30分钟的记录中，奔跑增加了大多数神经元的平均ΔF/F，奔跑调制指数（MI）显示神经元活动在奔跑期间增强。进一步分析发现，38.2%的记录的神经元在奔跑开始时其活动显著增加。其次，他们研究了ACC神经元在不同疼痛刺激范式下的活动。结果显示，与非伤害性的0.4克von Frey纤毛刺激相比，伤害性的27G针刺（pin prick）刺激引起了ACC神经元更强的钙活动反应，表现为更高的峰值ΔF/F以及更多比例的神经元被激活。最后，研究人员还探究了在化学遗传学抑制初级体感皮层（S1）活动后，ACC中间神经元对针刺刺激的反应，发现S1失活后，ACC中间神经元对伤害性刺激变得更加敏感，提示它们接收来自S1的伤害性信息。

这项研究成功地证明，贝塞尔光束的独特特性——如延长的景深、更高的横向分辨率以及对光学像差的相对不敏感性——能够极大地促进微型多光子显微镜的设计。miniBB2p以其轻量化、低牵绊、光学结构简单和荧光收集效率最大化等特点，实现了在自由活动动物身上，以突触分辨率对三维体积内的神经动力学进行长期、稳定的监测。它不仅克服了现有技术的显著挑战，其高通量容积成像能力使得在群体水平上研究如运动控制和疼痛处理等复杂行为背后的神经机制成为可能。该设计的简易性和成本效益，有望降低头戴式多光子显微镜广泛应用的门槛，为在更自然的行为状态下解析大脑功能提供了强大的新工具。未来，通过集成快速轴向扫描单元或使用空芯光子带隙光纤等技术，其成像通量和性能还有望得到进一步提升。