Akkermansia muciniphila通过GDNF信号调控TLR4/NEDD4/CX43轴改善帕金森病便秘-抑郁共病的新机制

《npj Parkinson's Disease》：GDNF signaling modulation by Akkermansia muciniphila ameliorates constipation–depression comorbidity in Parkinson’s disease

本研究针对帕金森病(PD)中便秘与抑郁共病(PD-CD)的病理机制不明问题，首次揭示肠胶质细胞(EGCs)通过TLR4/NEDD4/CX43信号轴异常活化导致ATP持续释放，进而抑制肠嗜铬细胞(ECs)5-HT合成的分子通路。研究发现GDNF通过Ret-Src通路竞争性结合TRAF6，阻断NEDD4泛素化降解，促进CX43清除，而益生菌Akk11可诱导内源性GDNF表达，为帕金森病非运动症状的干预提供新策略。

　　

当谈及帕金森病，人们往往首先想到的是震颤、僵硬等运动症状。然而，在疾病早期，便秘和抑郁等非运动症状可能早已悄然出现，严重影响患者生活质量。特别值得注意的是，便秘和抑郁常常结伴而行，这种"便秘-抑郁共病"现象背后隐藏的生物学机制至今成谜。

近年来，科学家们将目光投向连接肠道与大脑的"肠-脑轴"，试图解开这一谜团。肠胶质细胞(EGCs)作为肠道神经系统中的关键角色，可能是调控这一过程的核心。在帕金森病的病理状态下，肠道内究竟发生了什么？为何便秘和抑郁会如影随形？这些问题的答案可能就隐藏在肠胶质细胞与肠嗜铬细胞(ECs)的对话中。

发表在《npj Parkinson's Disease》的这项研究为我们提供了全新视角。研究人员发现，帕金森病中肠胶质细胞通过TLR4/NEDD4/CX43信号轴的异常活化，导致连接蛋白43(CX43)在细胞膜上大量积聚，形成持续的ATP泄漏。这种嘌呤能毒性环境会抑制肠嗜铬细胞中5-羟色胺(5-HT)的合成，从而同时引发肠道运动障碍和情绪异常。

更为重要的是，研究揭示了胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在这一过程中的保护作用。GDNF通过激活Ret-Src信号通路，能够竞争性结合TRAF6，阻断NEDD4的泛素化降解，进而促进CX43的清除，恢复5-HT合成。而令人惊喜的是，下一代益生菌Akkermansia muciniphila Akk11(Akk11)能够诱导内源性GDNF表达，产生类似的保护效果。

关键技术方法概述

研究采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的帕金森病样小鼠模型，通过立体定位注射建立脑部损伤模型。利用腺相关病毒(AAV)介导的GDNF过表达技术，结合TLR4激动剂RS09干预，在体内外验证信号通路。通过蛋白质免疫印迹(Western blot)、免疫荧光、共免疫沉淀(CO-IP)和分子对接等技术分析蛋白表达与相互作用。采用转录组测序筛选差异基因，通过肠道运动功能测定、尾部悬吊实验和糖水偏好试验评估便秘和抑郁样行为。益生菌干预采用Akk11灌胃处理，菌株来源于健康婴儿粪便样本(DSM 35205)。

GDNF缓解6-OHDA小鼠模型便秘，恢复结肠5-HT分泌并改善抑郁样行为

研究人员首先通过脑部立体定位注射6-OHDA建立帕金森病样小鼠模型，证实模型成功诱导后，通过腹腔注射AAV-GDNF实现GDNF过表达。结果显示，GDNF干预显著改善了6-OHDA小鼠的24小时粪便重量、2小时粪便水分含量和肠道推进率，表明便秘症状得到缓解。

同时，GDNF过表达显著增加了结肠组织中5-HT含量，减轻了小鼠在尾部悬吊实验中的不动时间，提高了糖水偏好率，说明抑郁样行为也得到改善。这些结果表明GDNF能够同时缓解帕金森病样小鼠的胃肠道功能和情绪障碍。

GDNF缓解EGCs中TLR4-TRAF6介导的炎症活化并改善6-OHDA小鼠结肠功能

通过转录组测序分析，研究发现6-OHDA模型小鼠结肠组织中TLR4通路相关基因显著富集。Western blot和免疫荧光结果显示，GDNF干预能够抑制TLR4及其下游炎症因子表达。当使用TLR4激动剂RS09后，GDNF的改善作用被逆转，证明GDNF通过阻断TLR4信号通路发挥作用。

进一步实验发现，TLR4激活促进了下游信号分子TRAF6的表达，而GDNF处理能够抑制这种异常升高。细胞实验中，RS09处理增加TRAF6表达，而GDNF干预可消除这一效应，证实GDNF通过抑制TLR4异常激活来降低EGCs中TRAF6的升高。

GDNF通过GDNF-Ret-Src信号竞争性结合TRAF6，阻断TRAF6介导的NEDD4泛素化降解

分子对接模拟显示，Src与TRAF6在Tyr198、Cys218等位点结合，而NEDD4与TRAF6在Ser207、Asp232等位点结合，提示存在竞争性结合关系。体内外实验证实，在RS09处理组中，TRAF6与Src结合减少，与NEDD4结合增加，而GDNF干预可逆转这一现象。

免疫荧光显示6-OHDA小鼠结肠EGCs中NEDD4表达下调，GDNF干预可改善这一现象，但RS09处理能取消GDNF的改善作用。CO-IP实验表明，RS09处理增加NEDD4泛素化修饰，GDNF干预后NEDD4泛素化增加消失，说明GDNF可能通过激活Src阻断TRAF6介导的NEDD4泛素化降解。

GDNF促进EGCs中NEDD4表达，靶向CX43进行泛素化降解

在GFAP-cre小鼠中构建6-OHDA+AAV-GDNF模型并注射RNAi-NEDD4病毒，发现NEDD4敲低后，GDNF对CX43表达的改善作用消失。分子对接显示NEDD4与CX43在Arg101、Glu104等位点结合。CO-IP和PLA-Duolink实验证实，RS09处理降低NEDD4与CX43结合，GDNF干预可增加结合。

泛素化检测显示，RS09组CX43泛素化减少，GDNF干预后增加，而NEDD4敲低后CX43泛素化几乎消失。这些结果证明NEDD4靶向CX43进行泛素化并参与其降解，而GDNF通过促进NEDD4表达来促进CX43的泛素化降解。

EGCs膜上CX43过表达创造细胞外高尿酸环境，增加ECs上P2Y12表达，负调控5-HT合成分泌

在EGCs中过表达CX43后，细胞外ATP含量显著增加。免疫荧光显示6-OHDA小鼠结肠ECs中P2Y12表达上调，GDNF干预可抑制这一上调。不同浓度ATP处理实验表明，随着ATP浓度升高，P2Y12表达上调，P2Y1和TPH表达下调。

体内受体拮抗剂实验显示，P2Y12受体拮抗剂PSB0739可改善6-OHDA小鼠的便秘和抑郁样行为，而P2Y1受体拮抗剂MRS2179可逆转GDNF组的改善作用，证明P2Y1和P2Y12受体分别对5-HT合成分泌起正负调控作用。

Akk11缓解6-OHDA小鼠模型便秘并改善抑郁样行为，与上调GDNF相关

Akk11灌胃处理可显著增加6-OHDA小鼠结肠组织中GDNF蛋白表达，改善肠道推进功能，减少尾部悬吊实验不动时间，提高糖水偏好率。体外实验也证实Akk11与EGCs共培养可提高GDNF表达，表明Akk11通过诱导内源性GDNF表达发挥保护作用。

研究结论与意义

本研究首次建立了帕金森病便秘-抑郁共病的"EGC-EC轴"模型，阐明了TLR4/NEDD4/CX43信号轴异常激活导致ATP泄漏和5-HT合成受损的统一分子机制。研究发现GDNF通过Ret-Src通路竞争性结合TRAF6，阻断NEDD4泛素化降解，促进CX43清除，从而缓解便秘和抑郁样行为。

值得注意的是，益生菌Akk11能够诱导内源性GDNF表达，产生与外源性GDNF类似的保护效果，这为帕金森病非运动症状的干预提供了全新的微生态策略。该研究不仅揭示了帕金森病非运动症状的共享病理机制，还为开发以GDNF为中心的多靶点治疗策略提供了理论依据。

研究的创新点在于将肠胶质细胞置于肠-脑轴调控的核心位置，发现了嘌呤能信号失衡在帕金森病便秘-抑郁共病中的关键作用，并提出了益生菌-GDNF联合干预的新理念。这些发现对理解帕金森病非运动症状的病理生理机制具有重要意义，为临床开发针对胃肠功能障碍和情绪障碍的协同治疗方案提供了新思路。