使用2bRAD-M技术对富含宿主的样本进行高分辨率微生物组分析，且不进行宿主去除处理

《npj Biofilms and Microbiomes》：High-resolution microbiome analysis of host-rich samples using 2bRAD-M without host depletion

宿主高背景微生物组测序新方法2bRAD-M的效率与准确性验证及其在口腔癌和龋齿诊断中的应用。摘要：2bRAD-M通过利用微生物与宿主基因组限制酶切位点的差异，高效富集微生物DNA，在90%-99%宿主DNA的样本中仍能保持93%以上的AUPR和L2相似性，显著优于16S测序。该技术仅需传统测序5%-10%的深度即可捕获物种分辨率特征，在唾液时间动态分析和口腔癌样本中均展现出与全基因组测序（WMS）高度一致性（R>0.97），并成功构建AUC=0.92的早期儿童龋齿诊断模型。

　　
本文针对高宿主背景（HoC）样本中微生物组分析的技术瓶颈，提出了一种新型测序方法——2bRAD-M。该方法通过利用微生物与宿主基因组中限制酶切位点的分布差异，在无需预先去除宿主DNA的情况下，显著提升微生物检测的灵敏度和准确性，同时大幅降低测序成本。

### 核心技术创新与优势
1. **选择性扩增技术**
2bRAD-M基于Type IIB限制酶BcgI的切位特性，发现微生物与宿主基因组存在150倍以上的酶切位点密度差异。通过设计双末端测序策略，仅保留具有物种特异性短串联重复序列（STR）的微生物DNA片段，成功规避宿主DNA的干扰。这种生物标记选择性扩增技术（BSA）使得在宿主DNA占比高达99%的样本中，仍能检测到低丰度微生物。

2. **数据库优化策略**
研究团队整合了GTDB r202数据库与EnsemblFungi真菌基因组数据库，构建了包含259,388个微生物基因组数据的2b-Tag-DB。通过预计算每个物种特有的32bp限制酶切片段，将平均物种分辨率提升至98.65%，解决了传统宏基因组学方法在复杂HoC样本中存在的数据库匹配偏差问题。

3. **动态去噪算法**
开发新型生物信息学处理流程，包含三个关键步骤：
- **污染校正**：通过阴性对照样本建立实验室背景污染模型，动态修正样本中的人源DNA干扰
- **特异性筛选**：采用G-score阈值（G=√(S×t)），其中S为序列覆盖度，t为标记特异性，有效过滤非目标序列
- **动态数据库扩展**：根据样本特征自动补充候选物种的酶切标记，提升低丰度微生物的检测灵敏度

### 技术验证与性能表现
1. **模拟实验验证**
在包含20种细菌的合成社区（MSA 1002）中，掺入90%和99%人类DNA的样本测试显示：
- 2bRAD-M在物种水平检测准确率（AUPR）达93.7%，显著优于16S测序（AUPR=78.2%）和传统WMS（AUPR=88.4%）
- L2相似性指标显示，2bRAD-M与WMS的物种丰度匹配度达94.7%，而16S测序仅83.9%
- 在99% HoC条件下，2bRAD-M仍能检测到0.01%丰度的微生物，而传统方法检测下限提升至0.1%

2. **临床样本验证**
（1）**唾液昼夜动态研究**
- 在8名健康受试者的日间唾液样本中，2bRAD-M成功捕捉到16种具有显著昼夜节律变化的微生物（如Porphyromonas endodontalis在下午5点较早晨9点减少37.2%）
- 与WMS的Bray-Curtis距离矩阵R值达0.97，验证了方法间的生物学一致性
- 通过qPCR验证，2bRAD-M对P. endodontalis的定量检测误差率<2%

（2）**口腔癌组织诊断**
- 在4例口腔鳞状细胞癌样本中，2bRAD-M与WMS的物种水平相似度达98.2%
- 开发基于随机森林的ECC诊断模型，AUC值达0.92（95%CI:0.86-0.97）
- 关键鉴别菌种包括：S. mutans（AUC贡献度28.6%）、Mitsuokella（22.3%）、Bifidobacterium dentium（19.8%）

3. **测序效率对比**
- 在相同测序深度（20M reads）下，2bRAD-M可检测到2.3倍于WMS的微生物物种
- 建立样本特异性测序深度阈值模型：当2bRAD-M测序深度达到5M时，Alpha多样性（Shannon指数）和Beta多样性（Bray-Curtis距离）指标与深度20M时差异<1%
- 降本效果显著：在口腔癌样本检测中，2bRAD-M仅需WMS的5-7%测序量即可达到相同诊断效能

### 临床应用价值
1. **早期儿童龋齿诊断**
- 通过机器学习模型筛选出4种核心鉴别菌种（S. mutans、P. acidifaciens、Mitsuokella sp、B. dentium），组合使用诊断AUC提升至0.91
- 发现Candida albicans在ECC患者中相对丰度增加2.3倍（p<0.01）
- 建立了首个基于多组学（宿主基因+微生物组）的ECC早期预警模型，敏感度达89.5%

2. **宿主-微生物互作研究**
- 在口腔癌样本中，检测到12种宿主特异性菌群（如人源共生菌Lachnospiraceae）
- 发现宿主基因表达水平与微生物组动态存在显著相关性（Pearson's R=0.82，p<0.001）
- 首次揭示口腔癌免疫微环境中Myxococcus xanthus等放线菌的调控作用

### 方法学改进与局限
1. **技术优化**
- 开发双通道测序标记：通过Primer1（宿主特异性）和Primer3（微生物特异性）组合，将宿主DNA污染降低至0.8%
- 建立"三级验证体系"：将物种注释流程分为初始匹配（GTDB）、二级验证（EnsemblFungi）、三级校准（临床数据库）
- 引入动态阈值算法：根据样本背景自动调整检测灵敏度（0.01%-1%丰度）

2. **现存挑战**
- 数据库依赖性：目前菌种注释准确率受GTDB数据库更新速度制约（当前覆盖89.7%的物种）
- 菌群复杂性：在混合感染样本中，未检测到<0.05%丰度的潜在致病菌
- 临床转化瓶颈：样本预处理时间（2.5h）仍高于传统WMS（4h）

### 未来发展方向
1. **多组学整合平台**
开发整合宿主基因组（WGS）、代谢组（LC-MS）和微生物组（2bRAD-M）的跨组学分析系统，计划2024年完成原型开发。

2. **自动化处理流程**
引入微流控芯片技术，将样本预处理时间压缩至30分钟内，预计2025年实现商业化。

3. **临床验证扩展**
已完成对12种口腔疾病的多中心验证（n=532），发现3种新的鉴别菌群（Chryseobacterium、Rothia、Prevotella），相关成果已提交至《Nature Communications》。

该研究为解决临床HoC样本分析难题提供了创新解决方案，在保持高诊断精度的同时将测序成本降低至传统方法的17%，特别适用于大规模流行病学调查和精准医疗场景。未来通过结合单细胞测序技术，有望实现宿主细胞与微生物的共定位分析，推动宿主-微生物互作机制研究进入新阶段。