利用基于行为-生物标志物-血脑屏障（BBB）筛选流程的多种癫痫模型，快速识别异吡哌啶林的抗癫痫活性

《Phytomedicine》：Rapid antiepileptic activity identification of isopimpinellin using a multi-model of epilepsy based on behavior-biomarker-BBB screening pipeline

抗癫痫候选化合物ISOP通过抑制CSF1/CSF1R通路发挥疗效，建立行为-生物标志物-血脑屏障-计算模型多维度筛选策略。

　　
癫痫作为一种全球性的神经系统疾病，其发病机制涉及离子通道异常、神经递质失衡、代谢紊乱及神经炎症等多重因素。现有抗癫痫药物（AEDs）虽能控制癫痫发作，但长期使用易引发认知障碍、肥胖等副作用，且约30%患者对现有药物无应答。这种双重困境促使研究转向具有多靶点、低毒性的传统中药成分。近年来，以《神农本草经》为代表的典籍记载了多种中药对癫痫的疗效，如钩藤（Gastrodia elata）、人参（Panax ginseng）等，但其作用机制尚未完全阐明。

本研究的创新性在于构建了"行为-生物标志物-血脑屏障渗透性"三位一体的筛选体系。首先通过小鼠癫痫模型（如海马区注射Kainic acid）筛选候选成分，重点监测c-fos/c-jun等促炎蛋白的表达水平，这些分子在人类癫痫患者海马组织中异常激活，与神经炎症直接相关。随后引入平行人工膜渗透实验（PAMPA），该技术通过模拟血脑屏障的脂质双分子层结构，可筛选出既具有药理活性又具备血脑穿透能力的候选物。值得注意的是，传统筛选方法往往忽视血脑屏障穿透性这一关键环节，导致约70%的候选药物无法进入中枢神经系统发挥作用。

在计算模型的构建中，研究团队创新性地整合了聚类分析（基于化合物-靶点相互作用网络）、药代动力学规则（Lipinski五规则）和临床药物相似性评估。通过比较730种中药成分与FDA已批准AEDs的结构特征，筛选出兼具药效团和合理药物化学性质的候选物。这种多维度计算筛选显著提高了候选物的临床转化潜力，研究显示其筛选效率较传统方法提升3.2倍。

实验验证部分采用双模型体系增强可靠性：在斑马鱼模型中，通过非侵入式EEG记录到PTZ诱导的癫痫样放电被有效抑制，且ISOP（Cnidium monnieri的活性成分）表现出2-3倍的延迟保护效应。动物实验进一步证实，ISOP能将小鼠的Racine评分降低3分（满分28分），且在72小时后仍能维持治疗效果。机制研究揭示，ISOP通过抑制CSF1/CSF1R信号通路发挥抗癫痫作用，该通路调控小胶质细胞的激活状态。蛋白质组学分析发现27个差异蛋白，其中CSF1R下调达1.8倍，而促炎介质IL-1β和TNF-α的表达分别降低62%和58%。这种多靶点调控机制解释了为何ISOP对复杂病因的癫痫模型（如炎症性癫痫）表现出显著疗效。

与传统中药研究不同，本研究特别关注了药物成分的系统性筛选。通过建立包含行为学（鱼的运动轨迹分析）、生物标志物（c-fos/c-jun蛋白表达）、药物代谢动力学（PAMPA渗透率）和计算化学（ADMET预测）的四维筛选模型，成功将候选物筛选效率提升至1.5%的惊人比例。这种整合式方法不仅解决了传统筛选中"活性不穿透屏障"的痛点，还通过临床药物相似性分析（计算与已上市AEDs的分子对接相似度）确保了候选物的药代动力学合理性。

研究发现的ISOP（7-羟基-6-甲氧基-8-苯基香豆素）具有独特的作用机制：一方面通过抑制CSF1受体减少小胶质细胞活化，另一方面促进星形胶质细胞分泌神经营养因子（BDNF增加42%）。这种双向调节机制突破了传统AEDs仅作用于单一靶点的局限，为治疗耐药性癫痫提供了新思路。值得注意的是，ISOP的分子量（286.36 Da）和脂溶性（logP=2.3）完美符合Lipinski规则，同时其与拉莫三嗪（Lamotrigine）的分子对接相似度达78%，预示着良好的临床转化前景。

在技术路线设计上，研究团队采用了递进式筛选策略：首先通过行为学观察（斑马鱼癫痫模型）和生物标志物检测（c-fos/c-jun免疫组化）建立初步候选库；然后用PAMPA快速评估血脑屏障穿透性，将通过率从初筛的5%提升至12%；最后通过计算模型（ADMET预测、临床药物相似性）缩小至最终11个候选物。这种分阶段筛选既节省了实验成本，又避免了传统高通量筛选中"假阳性"过多的问题。

研究还突破了传统中药研究的瓶颈，首次将动物模型（C57BL/6小鼠）与计算模型（QSAR建模）结合验证机制。通过比较ISOP处理组与VPA对照组的蛋白质表达谱，发现ISOP不仅调控炎症通路，还通过影响线粒体自噬相关蛋白（如p62/SQSTM1）改善神经元能量代谢。这种多维度机制解析为中药成分的精准研发提供了科学依据。

临床转化方面，研究团队特别关注了ISOP的毒理安全性。通过PAMPA模型筛选出的候选物均具有低于0.5%的细胞毒性，且在SDS-PAGE电泳中未出现明显蛋白降解。更值得关注的是，ISOP对正常小鼠海马神经元电活动的影响小于5%，显示出良好的选择性。这种安全性优势可能源于其独特的香豆素结构，既具备调节神经炎症的作用，又避免了传统香豆素类成分的肝毒性问题。

该研究对中医药现代化具有重要启示。通过建立标准化筛选流程，将传统经验用药转化为基于现代药理学证据的精准治疗。未来研究可进一步探索ISOP在基因编辑小鼠模型（如APP/PS1阿尔茨海默病模型）中的跨疾病治疗效果，以及与现有AEDs的联用方案。此外，斑马鱼模型的神经环路可视化技术（如活体钙成像）将有助于揭示ISOP作用的具体神经解剖位置。

在实验设计上，研究团队采用了"三步验证法"确保结果可靠性：首先通过斑马鱼模型（成本低、筛选快）进行初步活性测试；其次用PAMPA评估血脑屏障穿透性，筛选出3个候选物；最后通过小鼠癫痫模型验证药效，并利用蛋白质组学解析机制。这种阶梯式验证策略将整体研究周期缩短至传统方法的1/3，同时将机制解析深度提升至分子蛋白水平。

值得注意的是，研究团队在伦理审查方面建立了双重保障机制：实验前需通过动物伦理委员会（编号SWS20220322）的严格审批，实验中采用斑马鱼（伦理豁免物种）和小鼠模型（符合3R原则），所有动物实验均遵循"替代、减少、优化"的国际标准。这种伦理规范不仅符合国际期刊要求，也为后续临床转化奠定了合规基础。

从产业转化角度，研究团队已与Med Chem Express公司合作，建立了包含730种传统中药成分的标准化数据库（HY-L065）。该数据库不仅包含化学结构信息，还整合了细胞活性、PAMPA渗透率、ADMET预测等12个筛选维度数据，为后续药物开发提供了重要资源。目前，ISOP的合成工艺已通过中试，成本较天然提取物降低40%，这显著提升了其临床应用可行性。

该研究在方法学上实现了多项突破：首次将PAMPA技术引入中药抗癫痫筛选（效率提升60%），开发了基于机器学习的ADMET预测模型（准确率达89%），建立了包含行为学、生物标志物、代谢组学、蛋白质组学的多组学验证体系。这些技术创新为天然产物药物研发提供了标准化流程，推动了中医药现代化进程。

在机制解析方面，研究团队发现ISOP通过双重作用路径：直接抑制CSF1R受体活性（IC50=2.3 μM），间接调控microglia的代谢重编程。具体表现为：在巨噬细胞中，ISOP促进PPARγ信号通路（激活率提升35%），同时抑制NLRP3炎症小体（活性降低62%）。这种多靶点调控机制解释了为何ISOP对难治性癫痫（合并炎症和代谢异常）显示出显著疗效。

研究还特别关注了药物成分的体内代谢过程。通过LC-MS/MS技术检测到ISOP在肝脏中经CYP450酶系代谢为活性代谢物M1（半衰期延长至4小时），其药效强度是原药的1.8倍。这种代谢特性可能解释了ISOP在动物模型中表现出的长效性（72小时持续保护效应）。相关代谢研究已申请PCT国际专利（专利号PCT/CN2024/XXXXXX），为后续开发代谢增强型新药奠定基础。

在应用场景方面，研究团队开发了两种新型筛查模型：基于斑马鱼脑电信号的自动化分析系统（处理速度达500样本/小时），以及基于微流控芯片的PAMPA高通量筛选平台（每板可容纳96个化合物）。这些技术创新使传统需要数月的筛选工作缩短至2周，成本降低70%，为天然产物药物研发提供了可复制的标准化流程。

该研究对全球癫痫治疗格局产生深远影响。据统计，目前全球每年新增约600万癫痫患者，其中70%生活在发展中国家。ISOP作为首个通过血脑屏障的中药抗癫痫成分，其治疗窗较传统药物拓宽2倍（半数有效剂量范围达0.5-5 μM）。更值得关注的是，ISOP对儿童失神发作（占癫痫病例的20%）和青少年肌阵挛发作（占15%）显示出独特疗效，这为精准分型治疗提供了新可能。

在后续研发规划中，研究团队制定了三阶段开发路线：第一阶段（1-2年）完成临床前安全性评价（包括生殖毒性、致畸性等），第二阶段（3-5年）开展II期临床试验（目标人群为药物耐药性癫痫患者），第三阶段（6-8年）推进III期临床试验（对照药物为左乙拉西坦）。目前，已获得国家自然基金（82574783）和泰山学者计划（tsqn202312233）资助，计划在2025年前完成GMP生产线的建设。

该研究的重要启示在于：传统中药的现代研究不应局限于活性成分分离，而应建立"成分-靶点-通路-疾病"的全链条研发体系。通过整合行为学、生物标志物、代谢组学等多维度数据，研究者不仅能快速筛选候选物，还能精准解析作用机制，为中药现代化提供可复制的技术路径。这种研究范式转变，或将推动全球天然药物研发进入精准化、智能化新阶段。