《Osteoarthritis and Cartilage》：E1K, a disease-modifying drug candidate for knee osteoarthritis, alleviates pain and regenerates cartilage simultaneously by inhibiting TGF-β1-mediated SMAD1/5/9 signaling in osteoarthritis models
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骨关节炎（OA）中TGF-β1信号失衡导致软骨降解和疼痛，E1K肽通过特异性抑制ALK1-SMAD1/5/9通路，恢复ALK1/ALK5平衡，减少MMP13和COL10A1表达，同时降低NGF水平，在OA大鼠和小鼠模型中显著缓解疼痛并改善软骨结构。
文贞敏（Eun-Joung Moon）|金智爱（Ji Ae Kim）|张允实（Yunsil Jang）|金贤贞（Hyeon-Jeong Kim）|朴相哲（Sang-Je Park）|李哲民（Cheolmin Lee）|姜南淑（Nam Sook Kang）|金海珍（Hae-Jin Kim）
新药物研究所，Ensol Biosciences Inc.，韩国大田市裕城区Techno 10-ro 51号，邮编34036
摘要
目的
转化生长因子-β1（TGF-β1）信号通路在关节稳态和骨关节炎（OA）发病机制中起着关键作用。Engedi 1000（E1K）是一种新型短肽，能够选择性调节TGF-β1诱导的SMAD1/5/9信号通路。我们评估了E1K在骨关节炎模型中的镇痛效果和结构修饰作用。
设计
通过分子对接和表面等离子体共振（SPR）技术研究了E1K与TGF-β1的结合情况。在人类软骨细胞和牛成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）中检测了E1K的分子效应。利用von Frey试验评估了E1K在单钠碘乙酸（MIA）诱导的骨关节炎大鼠模型中的镇痛效果。通过OARSI评分和免疫组化（II型胶原、MMP13、ALK1和ALK5）评估了E1K在前交叉韧带断裂（ACLT）诱导的骨关节炎兔子模型中的结构修饰作用。
结果
分子对接预测并证实了E1K与TGF-β1的结合。在人类软骨细胞中，E1K选择性抑制了TGF-β1诱导的SMAD1/5/9信号通路，同时保持了SMAD2/3的磷酸化。E1K降低了分解代谢标志物（MMP13、COL10A1）的表达水平，而COL2A1的表达水平未受影响。在牛成纤维细胞样滑膜细胞中，E1K显著抑制了TGF-β1诱导的NGF表达。在MIA模型中，E1K在最高剂量下显著减轻了机械性痛觉过敏。在ACLT模型中，E1K改善了软骨完整性，降低了OARSI评分，并减少了ALK1/ALK5的表达比例。
结论
E1K通过抑制分解代谢信号通路并促进软骨再生，使TGF-β1信号通路向合成代谢方向转变，表明其作为具有镇痛和结构保护双重功效的骨关节炎改良药物具有潜力。
引言
骨关节炎（OA）是一种慢性进行性关节疾病，影响着全球数百万人。它是老年人疼痛和残疾的主要原因[1]、[2]。尽管OA传统上以关节软骨的结构退化为特征，但最近的研究认为疼痛和关节功能受损是其最严重的临床表现[3]。尽管OA的患病率和影响巨大，目前的药物治疗主要通过镇痛药和非甾体抗炎药提供症状缓解，这些药物无法改变疾病进程或阻止结构恶化[4]、[5]。此外，至今尚未有获批用于临床的骨关节炎改良药物（DMOAD），这凸显了迫切需要针对OA发病机制中关键分子途径的新疗法[5]、[6]。
DMOAD有望减缓或阻止结构进展，并缓解疼痛和功能受限等症状。然而，这些治疗目标涉及不同的生物学途径，给开发有效的DMOAD带来了挑战。因此，针对结构降解的关键调节因子是一种合理的治疗策略。
最近的研究强调了转化生长因子-β1（TGF-β1）在软骨稳态和OA进展中的核心作用[7]、[8]。TGF-β1招募I型受体和活化素样激酶（ALKs），后者决定了下游信号通路的特异性。ALK5促进SMAD2/3的磷酸化，从而驱动合成代谢反应，如II型胶原（COL2）和聚集蛋白的生成。相比之下，ALK1介导SMAD1/5/9的磷酸化，导致分解代谢基因的表达，包括基质金属蛋白酶13（MMP13）和X型胶原（COL10）[9]、[10]。在健康的软骨中，低水平的TGF-β1主要激活ALK5–SMAD2/3通路以维持组织稳态[11]、[12]。然而，在OA软骨中，高水平的TGF-β1使平衡偏向ALK1信号通路，促进软骨降解[13]。因此，ALK1/ALK5的失衡可能是OA的一个有前景的治疗靶点[14]。
在本研究中，我们发现了一种新型短肽E1K，它能够与TGF-β1结合并选择性抑制ALK1–SMAD1/5/9信号通路，从而恢复ALK1/ALK5的平衡。此外，我们使用体外实验以及兔子和大鼠的前交叉韧带断裂（ACLT）和单钠碘乙酸（MIA）诱导的骨关节炎模型，研究了其作用机制和治疗潜力。我们发现E1K选择性抑制了TGF-β1介导的ALK1–SMAD1/5/9通路，同时保持了ALK5–SMAD2/3信号通路。通过恢复ALK1/ALK5的平衡，E1K有助于维持软骨稳态。
尽管神经生长因子（NGF）的表达通常与ALK5–SMAD2/3通路相关，但E1K尽管仅选择性抑制ALK1–SMAD1/5/9通路，却意外地降低了NGF的表达。这一意外发现表明E1K可能具有防止软骨降解和调节镇痛效果的作用。总体而言，这些结果表明E1K是一种有前景的骨关节炎改良药物候选物。
肽的合成
E1K（Glu1-Leu2-His3-Leu4-Asp5）肽是在Ensol Biosciences Inc.（韩国大田）使用标准Fmoc固相肽合成方法合成的。粗肽通过制备型高效液相色谱（HPLC）纯化，并通过核磁共振、红外光谱和质谱进行表征。分析数据见补充图1。
表面等离子体共振（SPR）
使用...
新型TGF-β1结合肽E1K的发现和结构分析
通过对比六种物种（人类、牛、猴子、兔子、小鼠和大鼠）的decorin（DCN）和biglycan（BGN）的序列，我们在TGF-β1结合域中鉴定出一个保守的E1K基序（ELHLD）（图1A）。为了检测E1K与TGF-β的直接结合，我们进行了SPR实验，结果显示TGF-β1与固定的E1K之间存在浓度依赖性的结合。在测试的配体中，包括TGF-β的多种异构体（TGF-β1、β2和β3）和BMP4，E1K对TGF-β1的结合亲和力最高。
讨论
在本研究中，我们发现E1K是一种新型短肽，它可以与TGF-β1结合并选择性抑制ALK1–SMAD1/5/9通路，同时保持ALK5–SMAD2/3通路。这种选择性调节与NGF表达的降低和疼痛行为的减轻（MIA模型）以及结构结果的改善（ACLT模型）相关，这与ALK1/ALK5活性向软骨稳态的重新平衡一致。
OA中的TGF-β信号通路具有情境依赖性[20]——它随疾病阶段和组织类型（软骨）而变化
作者贡献
- (1)
在工作的构思或设计；或数据的获取、分析或解释方面做出重大贡献：文贞敏（Eun-Joung Moon）、金智爱（Ji Ae Kim）、张允实（Yunsil Jang）、金贤贞（Hyeon-Jeong Kim）、朴相哲（Sang-Je Park）、李哲民（Cheolmin Lee）和姜南淑（Nam Sook Kang）。
- (2)
撰写或严格审阅工作的重要智力内容：文贞敏（Eun-Joung Moon）、金智爱（Ji Ae Kim）、张允实（Yunsil Jang）和金海珍（Hae-Jin Kim）。
- (3)
最终批准发表版本：金海珍（Hae-Jin Kim）。
- (4)
所有作者同意对工作的所有方面负责
利益冲突声明
除姜南淑（Nam sook Kang）外，其他作者均为Ensolbio Biosciences Inc.的现任员工，正在开发Engedi 1000。这并不影响我们遵守所有期刊关于数据和材料共享的政策。姜南淑声明没有财务利益冲突。
