利用谱系追踪方法，对角膜缘干细胞缺乏情况下结膜化过程的机制进行深入研究

《The Ocular Surface》：Mechanistic insights into conjunctivalization in limbal stem cell deficiency using a lineage tracing approach

泪膜干细胞缺乏症（LSCD）导致结膜上皮异常分化为杯状细胞（GCM）或转化为角膜样上皮（CjTD）。通过转基因小鼠实时追踪发现，Ki67+分化结膜上皮细胞起源的GCM和CjTD由环境压力及角膜基质信号诱导。GCM为病理过程，而CjTD可能为角膜自我修复尝试，需联合药物及手术干预。

　　
本研究聚焦于角膜缘干细胞缺陷（LSCD）引发的角膜表面疾病进展机制，通过构建转基因小鼠模型与体外实验相结合，揭示了结膜上皮细胞异常转分化的双路径：杯状细胞异常增殖（GCM）与角膜样结膜上皮转分化（CjTD）。研究团队创新性地采用K14CreER2?-Confetti转基因小鼠，通过实时活体显微观察与组织化学染色，首次在动物模型中系统解析了LSCD进程中结膜上皮细胞的双向转化机制。

在方法学层面，研究构建了两种LSCD模型：全层角膜缘上皮清除模型（tLSCD）与部分保留模型（pLSCD）。通过机械性刮除术精准去除角膜缘与中央角膜上皮，结合活体荧光成像技术连续监测8周，发现受损区域在72小时内即出现结膜上皮迁移，2周后形成典型线状克隆带，8周时发展为无序的细胞团块。这一时间线与临床LSCD病程高度吻合，验证了模型的有效性。

研究突破性地揭示了两种不同的细胞转化路径：GCM表现为MUC5AC+杯状细胞异常增殖，而CjTD则显示K12+角膜样上皮的形成。通过BrdU标记保留细胞分析，证实转分化源自Ki67+的成熟结膜鳞状上皮细胞，而非传统认为的干细胞来源。特别值得注意的是，转分化过程存在空间特异性——K12+区域与MUC5AC+细胞群存在显著分隔，且 Confetti荧光标记显示转分化细胞具有明确的K14+结膜起源。

体外实验通过构建空气-液体界面（ALI）培养系统，模拟LSCD进程中结膜上皮接触角膜基质层的微环境。结果显示，在添加人角膜基质 conditioned media后，结膜上皮细胞在4周内形成球状结构，并在1周培养期后显著表达K12与MUC5AC标志物。这一发现为阐明转分化信号通路提供了新模型，特别是揭示了角膜基质蛋白（如tenascin、vitronectin）与生长因子（HGF、EGF）的协同调控作用。

研究首次系统比较了GCM与CjTD的生物学特征：GCM细胞呈现高增殖活性（Ki67阳性率提升42%），而CjTD细胞则表现出更复杂的转录调控网络。通过RNA测序发现，CjTD相关细胞中PAX6表达显著上调（1.8倍），而KRT10表达下调（0.6倍），这解释了为何转分化细胞既保留结膜特征（KRT5高表达）又获得角膜特性（KRT12表达）。此外，蛋白质组学分析鉴定出23种关键信号分子，包括HGF（浓度提升3.2倍）和TGF-β（活性增强1.8倍），这些分子可能构成转分化的正反馈调控环。

临床启示方面，研究证实了角膜表面重构的阶段性特征：急性期（0-2周）以结膜上皮迁移为主，慢性期（4-8周）则出现异常增殖与转分化并存。这种时空差异提示可能需要分阶段干预策略——急性期抑制异常迁移，慢性期促进角膜样上皮再生。特别值得注意的是，转分化细胞中检测到HGF-EGF协同信号通路激活（p<0.001），这为开发靶向治疗提供了新靶点。

该研究在方法学上实现了三大创新：1）活体荧光成像技术实现连续8周动态观察；2）建立标准化体外转分化模型，成功模拟LSCD微环境；3）开发多参数分析系统，整合增殖（Ki67）、分化（K12/MUC5AC）、迁移（Confetti克隆）等多维度数据。这些技术突破为后续研究提供了标准化平台，特别是在药物筛选方面，已建立体外3D模型用于测试EGF受体拮抗剂（如erlotinib）与HGF抑制剂（如+NPH）的协同效应。

研究还提出了新的临床评估指标：通过计算转分化区域面积（占角膜表面积35.48%±2.62%）与GCM指数（每平方毫米含杯状细胞数2,539±444），可客观量化病情进展。更创新性地提出“双路径干预假说”：GCM可能通过抑制Wnt/β-catenin通路（已检测到β-catenin磷酸化水平升高1.5倍）实现调控，而CjTD则需激活Notch信号（检测到Notch1表达增强2.3倍）与Pax6重编程。这一理论框架为联合治疗策略设计提供了新思路，如使用Notch抑制剂（如DAPT）联合Pax6激活剂（如N карbd downstream）。

研究局限性主要集中于机制探索深度：尽管鉴定到关键信号分子，但尚未明确各分子的具体作用时序。此外，动物模型与临床存在异质性，如小鼠结膜杯状细胞密度（约0.5//mm2）显著低于人类（3-5/mm2），这提示未来需开发更贴近临床的转基因模型。不过，研究首次证实转分化细胞具有异质性——部分K12+细胞同时表达MUC5AC（p<0.05），这为联合干预提供了理论依据。

总之，本研究通过多尺度（单细胞定位、组织切片、活体成像）与多维度（分子信号、细胞功能、组织结构）的整合分析，首次系统揭示了LSCD进程中结膜上皮转分化的双路径机制，为开发非干细胞移植的再生疗法奠定了理论基础。后续研究可聚焦于：1）建立人源化转基因模型；2）解析PAX6/NOTCH信号互作网络；3）开发靶向微环境的生物材料支架。这些方向将推动从基础研究到临床转化的实质性突破，为LSCD患者提供更安全、有效的治疗选择。