ATP与两亲性小分子作为分子“媒人”精细调控FET蛋白亚饱和簇的形成

《Communications Chemistry》：ATP and small amphiphilic molecules act as molecular matchmakers to fine-tune FET protein clusters

本研究揭示了ATP及小分子两亲性物质如何作为分子“媒人”，在亚饱和浓度下精细调控FET蛋白簇的大小。研究人员发现，低浓度ATP（1-2 mM）通过非特异性交联作用促进FET蛋白（如FUS）形成更大的亚饱和簇，而高浓度（如10 mM）则使簇尺寸减小并稳定。类似效应也见于其他两亲性分子（如NaXS、NaTS、HD），表明其作用机制超越了传统水溶助长性或离子特异性理论，强调了蛋白质序列特异性化学性质与小分子固有化学特性之间的相互作用在调控生物分子缩合中的关键作用。这为理解细胞代谢物如何维持蛋白质稳态及神经退行性疾病相关蛋白聚集的调控提供了新视角。

　　

在我们身体的每个细胞中，都存在着一类名为FET（FUS-EWSR1-TAF15）的RNA结合蛋白家族。它们如同细胞内的“多面手”，在转录、剪接、RNA转运和代谢等关键生命过程中扮演着重要角色。这些蛋白质有一个非凡的特性：即使在浓度远未达到发生明显液-液相分离（LLPS）的阈值时，它们也能自发地组装成各种微米或纳米尺度的分子聚集体，即“亚饱和簇”。这些簇的形成被认为是调控细胞功能的一种重要方式，而其异常则与额颞叶痴呆（FTLD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）等严重的神经退行性疾病密切相关。

细胞内部是一个拥挤而繁忙的环境，充满了各种代谢物。其中，三磷酸腺苷（ATP）作为生命的“能量货币”，其平均浓度高达约4.4 mM。除了提供能量，近年来的研究提出ATP还可能作为一种“生物水溶助长剂”，帮助维持蛋白质的溶解性，防止其异常聚集。然而，对于ATP这种关键代谢物如何影响FET蛋白在亚饱和浓度下形成的、具有重要功能意义的“微簇”，我们此前知之甚少。理解这种调控机制，对于揭示细胞如何维持精细的蛋白质稳态，以及探索相关疾病的病理过程至关重要。

为了解决这一问题，来自莱布尼茨聚合物研究所德累斯顿分所的Mrityunjoy Kar在《Communications Chemistry》上发表了一项研究。该研究系统地探讨了ATP以及其他几种结构类似的小分子两亲性物质（如水溶助长剂二甲苯磺酸钠（NaXS）、甲苯磺酸钠（NaTS）和1,6-己二醇（HD））对FET蛋白家族成员（FUS、EWSR1、TAF15）在亚饱和浓度下形成 mesoscale 簇的调控作用。

为了开展这项研究，作者主要运用了几项关键技术。他们利用动态光散射（DLS）来实时监测蛋白质簇流体动力学直径随时间的变化，从而追踪簇的形成和生长动力学。通过纳米颗粒跟踪分析（NTA），研究人员能够获得簇的尺寸分布和颗粒浓度，更精确地量化簇的群体特征。此外，纳米差示扫描荧光法（NanoDSF）被用来探测小分子与蛋白质的相互作用如何影响蛋白质的热稳定性，为了解其作用机制提供了线索。研究所用的FET蛋白（包括SNAP标签版本和未标签版本）均通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行重组表达，并经过镍柱、麦芽糖结合蛋白标签纯化、蛋白酶切除标签以及尺寸排阻色谱等多步纯化，以获得高纯度的蛋白质样品。

ATP·Mg²⁺调控亚饱和FUS-SNAP簇的尺寸分布

研究人员首先以带有SNAP标签的FUS蛋白（FUS-SNAP）为模型，在低盐（10 mM KCl）条件下观察其亚饱和簇的形成。DLS结果显示，在0.25 μM和0.5 μM的FUS-SNAP浓度下，蛋白质簇的尺寸随时间逐渐增大。当加入ATP与其生理伴侣Mg²⁺形成的复合物（ATP·Mg²⁺）后，出现了浓度依赖性的调控效应：在低浓度（1-2 mM）下，ATP·Mg²⁺促进了更大簇的形成；而在中等浓度（5 mM）和高浓度（10 mM）下，簇的尺寸减小并趋于稳定。NTA和体积分数的测量结果与DLS数据相互印证。研究还发现，在pH 7.4和8.2的条件下，ATP·Mg²⁺的调控作用明显，而在pH 5.5（低于ATP磷酸基团的pK_a值）时作用减弱，提示磷酸基团的电荷状态对相互作用至关重要。

ADP和AMP而非腺苷调控亚饱和FUS-SNAP簇

为了确定ATP中哪个部分负责调控作用，研究人员逐步去除了磷酸基团，测试了二磷酸腺苷（ADP）、单磷酸腺苷（AMP）和腺苷的效果。结果显示，ADP和AMP在低浓度时也能促进簇生长，高浓度时则抑制簇的形成，其趋势与ATP·Mg²⁺相似。然而，腺苷在所有测试浓度下仅引起簇尺寸的轻微增加，没有明显的浓度依赖性调控。这表明磷酸基团是调控FUS-SNAP亚饱和簇形成的关键部分。

磷酸基团是调控亚饱和FUS-SNAP簇尺寸的关键

为了进一步验证磷酸基团的作用，研究使用了不含腺苷的多种磷酸盐，包括三聚磷酸钠（STPP）、焦磷酸钠（SPP）和磷酸钠（SP）。结果发现，这些磷酸盐分子在低浓度时同样能促进FUS-SNAP簇尺寸增大，高浓度时则抑制并稳定簇的尺寸。这强有力地证明，磷酸基团本身通过与蛋白质（尤其是富含精氨酸的序列）的相互作用，在调控亚饱和簇行为中扮演了核心角色。

常见水溶助长剂同样调控亚饱和FUS-SNAP簇的尺寸

接下来，研究探讨了典型的水溶助长剂NaXS和NaTS的作用。这些分子也表现出与ATP·Mg²⁺类似的浓度依赖性调控模式：低浓度促进簇生长，高浓度抑制簇的形成。然而，要达到与ATP·Mg²⁺相似的效应，所需NaXS或NaTS的浓度要高出一个数量级（约10倍）。这可能是由于ATP的磷酸基团带有更多负电荷，且蛋白质表面存在保守的磷酸结合位点，使其与蛋白质的结合亲和力更强。

己二醇（HD）调控FUS-SNAP簇的尺寸

研究还考察了具有两亲性的1,6-己二醇（HD）和亲水性更强的三乙二醇（TEG）。在亚饱和浓度（0.25 μM FUS-SNAP）下，HD和TEG仅轻微增加簇尺寸。然而，在会发生相分离的较高蛋白浓度（1 μM FUS-SNAP）下，高浓度的HD和TEG能显著减小簇的尺寸，且HD的效果强于TEG。这表明分子的疏水性在其调控作用中很重要。

未标签FUS的亚饱和簇形成与FUS-SNAP模式相似

为了排除SNAP标签的潜在影响，研究在未标签的FUS蛋白上重复了关键实验。结果表明，ATP·Mg²⁺、NaXS、NaTS对未标签FUS的亚饱和簇形成同样表现出浓度依赖性的调控，总体趋势与FUS-SNAP相似，证实了观察到的现象是FUS蛋白的固有特性。但在HD处理下，未标签FUS与FUS-SNAP的反应存在一些差异，提示标签可能对小分子相互作用有细微影响。

FET家族蛋白的序列组成调控其对ATP和小分子的响应

研究进一步将观察扩展到FET蛋白家族的其他成员EWSR1和TAF15。尽管总体调控模式相似（低浓度促进簇形成，高浓度抑制），但具体细节存在差异。例如，TAF15-SNAP需要更高的ATP·Mg²⁺浓度（>10 mM）才能观察到簇尺寸的稳定或减小，这可能与其更高的精氨酸含量和等电点（pI）有关。不同水溶助长剂（NaXS vs NaTS）对三种FET蛋白簇的抑制效力也因蛋白序列的差异而不同，突出了蛋白质特异性化学性质在响应小分子调控中的重要性。

与ATP和其他小两亲性分子的相互作用改变了FUS-SNAP的转变温度

NanoDSF实验结果显示，不同的小分子以不同的方式影响FUS-SNAP的热稳定性。例如，10 mM NaXS使蛋白的转变温度（T_m）显著升高，并在变性过程中伴随荧光红移，表明色氨酸残基在变性过程中暴露于溶剂。而高浓度ATP·Mg²⁺（10 mM）则使T_m降低。这些差异反映了小分子与FUS-SNAP之间相互作用的化学特异性，与其调控簇形成的能力相关联。

综上所述，这项研究揭示了ATP及小分子两亲性物质作为分子“媒人”，通过非特异性相互作用精细调控FET蛋白亚饱和簇形成的普遍规律。其作用模式呈现浓度依赖性：在低浓度时，它们作为温和的交联剂，通过其疏水部分与蛋白质芳香族残基的π-π相互作用，以及亲水部分（尤其是磷酸基团）与精氨酸、赖氨酸等碱性残基的静电相互作用，桥接多个蛋白质分子，从而促进更大簇的形成。在中等浓度时，这些分子在蛋白质表面达到一定的吸附饱和度，阻止了簇的进一步生长，从而起到稳定簇尺寸的作用。在高浓度时，它们通过饱和蛋白质表面的潜在相互作用位点，或通过改变溶剂环境，抑制簇的形成或使其溶解，但研究表明即使在高浓度下，较小的亚饱和簇仍然可以持续存在。

这项研究的结论挑战了将ATP的作用简单归因于“水溶助长性”或“离子特异性效应”的传统观点。研究者提出，这些小分子更像是一种“胶溶剂”，其作用可以用吸附-吸引平均场理论来解释，即瞬时的、非特异性的分子间“桥接”作用驱动了蛋白质的集体行为。更重要的是，研究强调了蛋白质自身的序列特征（如氨基酸组成、电荷分布、等电点）和小分子固有的化学性质共同决定了最终的调控效果。

该研究的发现具有重要的生物学意义。在体内，ATP的浓度在不同组织和细胞状态下是动态变化的（例如，大脑中约为2.88 mM，心肌中可达7.47 mM）。这种浓度差异可能导致ATP在不同细胞类型中对FET蛋白簇的调控作用存在差异。在神经退行性疾病如ALS和FTLD中，患者脑部往往观察到ATP水平降低以及FET蛋白的异常聚集。本研究提示，脑中相对较低的ATP水平可能不足以有效抑制或溶解有害的蛋白聚集前体，从而促进了疾病相关的病理聚集。因此，深入理解小分子代谢物如何调控蛋白质的亚饱和簇组装，不仅深化了我们对基础细胞生物学的认识，也可能为未来开发干预蛋白质异常聚集策略提供新的思路和靶点。