膀胱癌细胞中TRPV3通道的激活会刺激ATP的释放

《Molecular Pharmacology》：Activation of TRPV3 channels in bladder cancer cells stimulates ATP release

TRPV3通道在膀胱癌中的功能首次被证实，通过新发现的特异性agonist AV3-1显示其激活可调控Ca2+信号通路并受胆固醇代谢影响，为膀胱癌治疗和诊断提供新靶点。

　　

乔纳斯·雅嫩茨（Jonas Janenz）| 安德烈亚·莱佩（Andrea Leipe）| 尼科尔·乌尔班（Nicole Urban）| 米夏埃尔·谢弗（Michael Schaefer）| 克尔斯廷·希尔（Kerstin Hill）

鲁道夫-伯姆药理学与毒理学研究所（Rudolf-Boehm-Institute for Pharmacology and Toxicology），德国莱比锡H?rtelstrasse 16-18号，邮编04107

摘要

瞬时受体电位香草素3型（TRPV3）是一种对温度敏感的钙离子（Ca²⁺）通透性离子通道，在上皮屏障功能中起着关键作用。虽然其在皮肤中的表达和功能已经得到充分研究，在胃肠道中的研究较少，但其在膀胱中的作用尚未被探索。在本研究中，我们在人类膀胱癌细胞系中发现了TRPV3，并使用一种通过高通量筛选发现的新小分子激动剂AV3-1证明了其功能活性。AV3-1在钙离子测定和电生理记录中比已知的TRPV3激活剂具有更高的活性。TRPV3在KU-19-19膀胱癌细胞中的激活能刺激ATP的释放，这一效应可以通过药物阻断TRPV3来消除，从而证实了其靶点特异性。胆固醇补充进一步增强了KU-19-19细胞中的TRPV3活性，鉴于膀胱癌中胆固醇代谢的紊乱，这一发现具有潜在意义。这些结果首次证明了TRPV3在膀胱癌细胞中的功能性表达，并表明TRPV3可能参与依赖于钙离子和胆固醇的信号通路。

引言

TRPV3是一种对温度敏感的离子通道，主要表达在角质形成细胞中，在皮肤屏障的形成和维持中起重要作用。1, 2, 3, 4 其功能障碍与严重的皮肤疾病相关，这突显了其作为皮肤病治疗靶点的潜力。5, 6, 7

除了皮肤外，TRPV3还表达在多种其他上皮组织中，包括远端结肠，8, 9 其表达被认为是结肠癌发病的风险因素。10 相应地，结肠癌细胞系（如DLD-1细胞系）表现出高水平的TRPV3功能表达。8 其他报道有TRPV3表达的上皮组织包括支气管上皮、11 人类喉部、12 角膜上皮细胞和口腔黏膜。13 根据公开的数据集14（www.proteinatlas.org），在膀胱中也观察到低水平的TRPV3表达。然而，目前尚缺乏关于健康膀胱组织或膀胱癌细胞中TRPV3功能的数据。尽管TRPV3在膀胱生理和病理生理中的作用尚未被充分研究，但其他TRP通道在健康尿路上皮和膀胱癌细胞中已得到更广泛的研究。例如，TRPV4在尿路上皮中大量表达，其激活会导致感觉介质（如ATP）的释放。15, 16, 17 此外，在MBT-1小鼠膀胱癌细胞中检测到了TRPV2和TRPM7的功能性表达，这些通道被认为可以抑制肿瘤细胞的增殖。18

作为一种对温度敏感的离子通道，TRPV3在31°C至39°C的范围内被激活。4, 19 除了温度敏感性外，TRPV3还受到多种天然和合成化合物的调节。最常用的激活剂之一是2-氨基乙氧基二苯基硼酸盐（2-APB），常用于研究内源性表达该通道的细胞中的TRPV3功能。然而需要注意的是，2-APB会激活或抑制多种其他TRP通道，因此难以将其效应明确归因于TRPV3本身。20, 21, 22 此外，天然存在的单萜类化合物（如樟脑、香芹酚或香叶醇）24, 25 也能作用于TRPV3，但需要高浓度才能实现显著的激活效果，并且缺乏特异性。相比之下，KS0365对TRPV3的特异性较高，但在高浓度下可能会引起细胞内钙离子浓度的非特异性升高26，且其对人类TRPV3的激活效果较低。

利用AV3-1这种新的药理学工具，我们首次证明了TRPV3在膀胱癌细胞系中广泛表达。此外，我们的结果证实AV3-1是一种可靠且适用于多种物种的激活剂，可用于研究TRPV3介导的钙离子信号通路在尿路上皮癌中的功能作用。这些发现不仅为TRPV3通道的分子药理学提供了新的见解，也为探索其作为膀胱癌治疗靶点或生物标志物的潜力开辟了新的途径。

化学物质和试剂

HEPES缓冲盐水（HBS）由140 mM NaCl（默克公司，德国达姆施塔特）、6 mM KCl（卡尔罗斯公司，德国卡尔斯鲁厄）、1 mM CaCl₂、10 mM HEPES（卡尔罗斯公司）和5 mM 葡萄糖（默克公司）组成，用NaOH调节至pH 7.4。在某些实验中，HBS还含有0.1%的牛血清（BSA）（西格玛奥德里奇公司，德国慕尼黑）。Enamine多样性化合物库和AV3-1购自Enamine公司（乌克兰基辅）。AV3-1用100% DMSO稀释至100 mM的储备溶液。

结果

我们最近发现KS0365是一种强效的TRPV3通道激活剂。26 然而，在较高浓度（>10 μM）下，KS0365对HEK293细胞表现出非特异性效应，限制了其在天然TRPV3表达系统中的应用。为了发现具有更好选择性的新型TRPV3调节剂，我们使用Enamine药物发现多样性化合物库进行了高通量筛选，该化合物库包含50,000种化学结构多样的小分子。

讨论

多项研究表明，不同的TRP通道参与了尿路上皮膀胱的功能。例如，TRPV1表达在支配泌尿道的感觉纤维中。32 TRPV1缺乏的小鼠表现出异常的膀胱功能，表现为频繁的低幅度非排尿性收缩。33 相反，TRPV1表达增加与膀胱过度活跃的病理生理过程有关。34 在尿路上皮中，TRPV1的激活已被报道能触发一氧化氮（NO）的释放。

数据可用性声明

作者声明，支持本研究结果的所有数据均包含在论文及其补充数据中。

作者贡献声明

乔纳斯·雅嫩茨（Jonas Janenz）：研究、数据分析、概念构建。 安德烈亚·莱佩（Andrea Leipe）：研究、数据分析。 尼科尔·乌尔班（Nicole Urban）：研究、数据分析。 米夏埃尔·谢弗（Michael Schaefer）：写作、审稿与编辑、项目监督、资金获取、概念构建。 克尔廷·希尔（Kerstin Hill）：写作初稿、项目监督、资金获取、数据分析、概念构建。

作者贡献

克尔廷·希尔（Kerstin Hill）：概念构建、数据分析、资金获取、初稿写作、审稿与编辑、项目监督； 乔纳斯·雅嫩茨（Jonas Janenz）：概念构建、研究、数据分析； 安德烈亚·莱佩（Andrea Leipe）：研究； 米夏埃尔·谢弗（Michael Schaefer）：概念构建、资金获取、审稿与编辑； 尼科尔·乌尔班（Nicole Urban）：概念构建、研究、审稿与编辑。

致谢

膀胱癌细胞系由曼迪·伯恩特-佩茨（Mandy Berndt-Paetz，德国莱比锡大学泌尿科）慷慨提供。我们感谢玛丽昂·莱昂哈特（Marion Leonhardt）提供的技术支持。

资助

本工作得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号TRR152, P18）的支持，资助对象为K.H.和M.S.

所有作者均与本文内容无实际或潜在的利益冲突。